盾殼霉CmRV基因組的全長(zhǎng)cDNA克隆及轉(zhuǎn)化ZS-1的研究.pdf

1、盾殼霉(Coniothyrium minitans)是核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，在菌核病的生物防治中有著非常重要的作用。真菌病毒CmRV是來自盾殼霉菌株Chy-1的dsRNA病毒，它的全長(zhǎng)基因組的序列已被測(cè)序完成，屬于Totiviridae(全病毒)科，對(duì)寄主沒有顯著的影響。 本研究中采用反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)CmRV進(jìn)行研究，通過分段RT-PCR的方法分別克隆了病毒

2、基因組的5' 端和3'端cDNA片段，連接pMD18-T得到病毒全長(zhǎng)cDMA的亞克隆，再構(gòu)建全長(zhǎng)克隆的方法得到了含有全長(zhǎng)cDNA克隆的重組質(zhì)粒。 在研究過程中發(fā)現(xiàn)于2003年測(cè)定并提交的CmRV全序列多出了21個(gè)堿基，CmRV實(shí)際大小為4954nt。由于這21個(gè)堿基在3'端的非翻譯區(qū)，因此并不影響CmRV的分類地位和對(duì)其所表達(dá)的外殼蛋白(CP)和依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)的推定。 通過酶切得到了CmRV全長(zhǎng)基因

3、組cDNA片段，連入p1301-V的構(gòu)巢曲霉的trpC啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)，得到了全長(zhǎng)cDNA的正向表達(dá)轉(zhuǎn)化載體pCmRV-cDNA(+)和反向表達(dá)轉(zhuǎn)化載體pCmRV-cDNA(-)：將構(gòu)建好的載體通過熱擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATMT)成功轉(zhuǎn)化盾殼霉ZS-1菌株。 對(duì)轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)分析表明病毒基因組已經(jīng)整合到盾殼霉ZS-1的染色體上，RT-PCR檢測(cè)表明病毒的基因在轉(zhuǎn)化子細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄，