豬Sox9基因cDNA的全長克隆及功能預(yù)測.pdf

1、Sox基-因是由眾多富含HMG盒DNA綁定蛋白區(qū)域的基因家族，Sox9屬于Sox家族成員之一，Sox9是與早期胚胎發(fā)育有關(guān)的基因，是與位于雄性動物Y染色體上的Sry相關(guān)的睪丸決定因子，可與DNA序列特異結(jié)合，在很多動物中都有表達(dá)，因此在進(jìn)化上非常保守。在人類SOX9突變可引起CD綜合征和性反轉(zhuǎn)。在睪丸和卵巢中都可以檢驗(yàn)到Sox9mRNA的轉(zhuǎn)錄本，暗示它在性腺發(fā)育的作用，顯示它在豬的性腺中可能具有同樣功能。對豬Sox9基因的克隆測序和初步

2、分析，可以為研究豬Sox9基因的生物學(xué)功能和品種改良提供基礎(chǔ)的基因信息，也為研究人的基因功能建立動物試驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁﹨⒖肌?本研究采用電子克隆的方法，結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得了豬Sox9基因的cDNA全序列。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，并進(jìn)行了同源序列多重比對和分子系統(tǒng)發(fā)生分析，利用實(shí)時定量PCR(Real-time quantitative PCR)技術(shù)分析了豬Sox9基因mRNA在不同組織的相對表達(dá)水

3、平，具體內(nèi)容如下： 1 Sox9基因的克隆測序 用人的Sox9基因的cDNA全序列作為電子探針，分別從NCBI的dbEST和UniGene數(shù)據(jù)庫釣取了共12條豬的EST序列，將其輸入DNAstar-SeqMan程序，最后拼接出1個重疊群( Contigl)序列。在此基礎(chǔ)上，利用Primer Premier5.0軟件手動設(shè)計引物，借助RT-PCR和RACE技術(shù)一方面驗(yàn)證了電子克隆的正確性；另一方面擴(kuò)增出ORF和cDNA全序

4、列。 2 Sox9蛋白的生物信息學(xué)分析 借助借助生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源和軟件，豬Sox9基因定位于12p13-p11，預(yù)測出完整的ORF編碼框，位于第357-1886bp核苷酸之間，開放閱讀框的長度為1530bp，編碼509個氨基酸殘基；通過對Sox9啟動子的預(yù)測，可能性高于0.8的有10個啟動子，從第187bp開始到第1541bp為CpG島，長度為1355bp.CpG位點(diǎn)有151個；通過對蛋白質(zhì)序列相似性檢索，預(yù)測出豬So

5、x9蛋白不含有信號肽，不含有跨膜區(qū)，定位于細(xì)胞核中，在509個氨基酸中從第104到174位共71個氨基酸殘基構(gòu)成HMG盒，功能區(qū)主要是HMG盒。發(fā)現(xiàn)有HMG、DnaJ、GIT、HSF和Prim-Zn-Ribbon結(jié)構(gòu)域。推測豬Sox9蛋白是一種核蛋白，有DNA結(jié)合能力，參與染色質(zhì)修飾和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 3 Real-time quantitative PCR分析Sox9基因的組織表達(dá)譜 采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，按照雙標(biāo)