miR--148a對(duì)心肌肥厚的作用與機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究目的:
  心力衰竭是由多種病生理因素共同導(dǎo)致的綜合征,導(dǎo)致慢性心衰的重要病因及病理學(xué)改變是病理性心肌肥厚,隨著對(duì)其發(fā)病機(jī)制不斷深入研究,分子生物學(xué)水平的調(diào)節(jié)逐漸受到更多關(guān)注。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)microRNA是參與調(diào)節(jié)心衰病理過(guò)程的重要機(jī)制之一。microRNA(miRNA)是長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA,具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)特性。miRNA可形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing

2、complex,RISC),通過(guò)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式特異性結(jié)合靶基因mRNA的3'非編碼區(qū),在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因蛋白表達(dá),從而調(diào)節(jié)生物體多種病生理過(guò)程,在心血管疾病中可參與并調(diào)節(jié)血管新生、心肌肥厚、心肌細(xì)胞及間質(zhì)纖維化、炎癥反應(yīng)、凋亡壞死等過(guò)程。心肌肥厚是以細(xì)胞體積增大、蛋白分泌增多及肌小節(jié)組織增加為特點(diǎn)的病理過(guò)程,其潛在觸發(fā)因素為血流動(dòng)力學(xué)紊亂、缺血損傷及神經(jīng)內(nèi)分泌失衡等多種病理?xiàng)l件,其內(nèi)在機(jī)制為胎兒基因再表達(dá)、興奮收縮耦聯(lián)

3、改變、能量代謝平衡改變等,已有研究表明許多miRNAs有正向或負(fù)向調(diào)節(jié)心臟肥厚的分子機(jī)制的功能。
  我們通過(guò)構(gòu)建SD大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型與心肌細(xì)胞肥大模型,檢測(cè)miR-148a的表達(dá)水平,并與對(duì)照組對(duì)比;并進(jìn)一步構(gòu)建miR-148a過(guò)表達(dá)腺病毒與miR-148a inhibitor轉(zhuǎn)染至大鼠心肌細(xì)胞中,觀察細(xì)胞相關(guān)心衰標(biāo)志分子的變化,明確miRNA-148a在心力衰竭中的作用,并進(jìn)一步探討miRNA-148a誘導(dǎo)心衰可能的靶基因

4、。
  研究方法:
 ?。ㄒ唬?gòu)建大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型
  訂購(gòu)180g~200gSD大鼠,禁食水24h后用10%水合氯醛麻醉,無(wú)菌環(huán)境下開(kāi)腹,用4號(hào)絲線與外徑為0.6mm的針管扎緊,移除針管,對(duì)照組不做結(jié)扎。飼養(yǎng)4w后處死取出心臟,利用HE染色觀察心肌形態(tài)變化,并行定量PCR檢測(cè)肥厚相關(guān)標(biāo)志分子,確定模型構(gòu)建成功。
 ?。ǘ?gòu)建原代心肌細(xì)胞肥大模型
  取出生1-2天的SD乳鼠,70%酒精消毒后無(wú)菌環(huán)境

5、下取出心室,并用膠原酶消化,并用差速離心三次分離心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞兩天后,加入Brdu,再無(wú)血清環(huán)境下培養(yǎng)24h,分別加入苯腎上腺素與血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。
 ?。ㄈz測(cè)miR-148a在肥大模型中的表達(dá)
  用Trizol法常規(guī)提取大鼠心肌組織RNA和肥大心肌細(xì)胞RNA,定量后利用頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異引物反轉(zhuǎn)錄microRNA,并行定量PCR檢測(cè),qRT-PCR使用SYRB GREENMIX試劑盒。

6、
 ?。ㄋ模?gòu)建過(guò)表達(dá)腺病毒與miR-148a inhibitor
  克隆相應(yīng)microRNA前體序列,并插入pADTrack-CMV穿梭質(zhì)粒,pmeⅠ線性化后轉(zhuǎn)化進(jìn)BJ5183感受態(tài)細(xì)菌,涂于卡那抗性LB板上過(guò)夜,Sganer測(cè)序篩選出正確的重組質(zhì)粒,并用lip2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293A細(xì)胞包裝病毒并擴(kuò)增,測(cè)定病毒滴度。在www.mirbase.org網(wǎng)站上檢索得到miR-148a的成熟序列,設(shè)計(jì)該序列的互補(bǔ)序列,對(duì)堿

7、基進(jìn)行2'甲氧修飾,其中合成和修飾序列由上海吉瑪公司完成。
  (五)雙熒光素酶報(bào)告基因
  生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其靶基因,將MAP3K4的mRNA3'UTR區(qū)插入熒光素酶質(zhì)粒中,再將質(zhì)粒與miRNA148a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,24h后裂解細(xì)胞,測(cè)定熒光素酶表達(dá)量并定量分析。
  (六)蛋白免疫印跡(western blot)
  microRNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)原代心肌細(xì)胞,用RIPA裂解液提取蛋白

8、,行western blot檢測(cè)分析靶基因蛋白表達(dá)情況,常規(guī)100v電泳,75v、2h濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,并用5%牛奶封閉2h,4℃冰箱孵育一抗過(guò)夜。并用TBST反復(fù)洗滌三次,每次約15min,避光孵育二抗2h,TBST再次洗滌三次,用顯影液顯影,并在Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)中掃描蛋白條帶并分析,以進(jìn)一步確定miRNA-148a能否調(diào)控MAP3K4表達(dá)。
 ?。ㄆ撸┙y(tǒng)計(jì)學(xué)分析
  計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方法表示,每組實(shí)

9、驗(yàn)重復(fù)至少3次,組件采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。我們默認(rèn)以P<0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  (一)心肌肥厚模型的驗(yàn)證
  1.SD大鼠心肌肥厚模型
  腹主動(dòng)脈縮窄是最常見(jiàn)的大鼠心衰模型構(gòu)建方法之一,本次實(shí)驗(yàn)中24只實(shí)驗(yàn)大鼠均成功存活,部分實(shí)驗(yàn)組SD大鼠出現(xiàn)消瘦,毛發(fā)稀疏等跡象。腹主動(dòng)脈縮窄飼養(yǎng)4w的大鼠心臟外形明顯大于對(duì)照組;另外實(shí)驗(yàn)組大鼠ANP、myh7顯著升高,myh6則變化不明顯;心臟H

10、E染色切片有明顯的肥厚改變,表明模型構(gòu)建成功。
  2.原代心肌細(xì)胞肥大模型
  心肌細(xì)胞分離后分別經(jīng)過(guò)PE與AngⅡ刺激,并用α-actinin抗體標(biāo)記做免疫熒光染色,在共聚焦顯微鏡下細(xì)胞直徑和表面積都增加,細(xì)胞形態(tài)較為飽滿,同時(shí)定量PCR結(jié)果驗(yàn)證。
 ?。ǘ﹎iRNA-148a在肥厚模型中表達(dá)降低
  我們用定量PCR檢測(cè)了在miRNA-148a在心肌組織以及PE、AngⅡ內(nèi)的表達(dá)水平,結(jié)果顯示在大鼠心肌肥

11、厚及AngⅡ誘導(dǎo)的肥大模型內(nèi),miRNA-148a均表達(dá)下降,與既往的研究結(jié)果相符。
  (三)過(guò)表達(dá)miR-148a促進(jìn)原代心肌細(xì)胞肥大
  用miRNA-148過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞,48h后qRT-PCR檢測(cè)miRNA-148表達(dá)量,與對(duì)照組相比,結(jié)果提示升高13倍左右,提示轉(zhuǎn)染成功。檢測(cè)ANP、myh6、myh7表達(dá)情況,其中ANP,myh7有顯著升高,myh6無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示過(guò)表達(dá)miR-148a能促進(jìn)心肌

12、肥厚。
 ?。ㄋ模┣玫蚼iR-148a可部分逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大
  構(gòu)建miR-148a inhibitor并轉(zhuǎn)染PE誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞,定量PCR檢測(cè)miR-148a表達(dá)水平;結(jié)果提示miR-148a表達(dá)下降約60%,可有效抑制其表達(dá);同時(shí)其ANP表達(dá)水平比PE刺激組相比有明顯下降,但較基礎(chǔ)水平仍有升高;提示降低miR-148a表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大。
 ?。ㄎ澹﹎iRNA-148a抑制MAP3K4的表達(dá)
 

13、 應(yīng)用TargetScan、microRNAorg等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索預(yù)測(cè)表明MAP3K4可能為miR-148a的潛在靶基因,故用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證,進(jìn)一步探討miR-148a調(diào)控心衰的潛在機(jī)制,結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-148a能顯著抑制MAP3K4-3'UTR區(qū)熒光素酶表達(dá),提示MAP3K4為miR-148a的靶基因。將過(guò)表達(dá)miR-148a過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)原代心肌細(xì)胞中,western blot結(jié)果顯示在MAP3K4蛋白表達(dá)水平明顯降低

14、,該結(jié)果同樣提示MAP3K4為miR-148a的靶基因。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
  在成功構(gòu)建的大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型與心肌細(xì)胞肥大模型中,ANP、myh7顯著升高,myh6表達(dá)降低或無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,同時(shí)miRNA-148a表達(dá)降低。
  在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miRNA-148a,能促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大,同時(shí)心肌細(xì)胞中敲低miR-148a,則可部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞肥大。
  miRNA-148a靶向作用于MAP3K4并能抑制該基因的表達(dá)

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