miR--148a對(duì)心肌肥厚的作用與機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　心力衰竭是由多種病生理因素共同導(dǎo)致的綜合征，導(dǎo)致慢性心衰的重要病因及病理學(xué)改變是病理性心肌肥厚，隨著對(duì)其發(fā)病機(jī)制不斷深入研究，分子生物學(xué)水平的調(diào)節(jié)逐漸受到更多關(guān)注。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)microRNA是參與調(diào)節(jié)心衰病理過(guò)程的重要機(jī)制之一。microRNA(miRNA)是長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)特性。miRNA可形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing

2、complex，RISC)，通過(guò)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式特異性結(jié)合靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)生物體多種病生理過(guò)程，在心血管疾病中可參與并調(diào)節(jié)血管新生、心肌肥厚、心肌細(xì)胞及間質(zhì)纖維化、炎癥反應(yīng)、凋亡壞死等過(guò)程。心肌肥厚是以細(xì)胞體積增大、蛋白分泌增多及肌小節(jié)組織增加為特點(diǎn)的病理過(guò)程，其潛在觸發(fā)因素為血流動(dòng)力學(xué)紊亂、缺血損傷及神經(jīng)內(nèi)分泌失衡等多種病理?xiàng)l件，其內(nèi)在機(jī)制為胎兒基因再表達(dá)、興奮收縮耦聯(lián)

3、改變、能量代謝平衡改變等，已有研究表明許多miRNAs有正向或負(fù)向調(diào)節(jié)心臟肥厚的分子機(jī)制的功能。
　　我們通過(guò)構(gòu)建SD大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型與心肌細(xì)胞肥大模型，檢測(cè)miR-148a的表達(dá)水平，并與對(duì)照組對(duì)比;并進(jìn)一步構(gòu)建miR-148a過(guò)表達(dá)腺病毒與miR-148a inhibitor轉(zhuǎn)染至大鼠心肌細(xì)胞中，觀察細(xì)胞相關(guān)心衰標(biāo)志分子的變化，明確miRNA-148a在心力衰竭中的作用，并進(jìn)一步探討miRNA-148a誘導(dǎo)心衰可能的靶基因

4、。
　　研究方法：
　?。ㄒ唬?gòu)建大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型
　　訂購(gòu)180g～200gSD大鼠，禁食水24h后用10％水合氯醛麻醉，無(wú)菌環(huán)境下開(kāi)腹，用4號(hào)絲線與外徑為0.6mm的針管扎緊，移除針管，對(duì)照組不做結(jié)扎。飼養(yǎng)4w后處死取出心臟，利用HE染色觀察心肌形態(tài)變化，并行定量PCR檢測(cè)肥厚相關(guān)標(biāo)志分子，確定模型構(gòu)建成功。
　?。ǘ?gòu)建原代心肌細(xì)胞肥大模型
　　取出生1-2天的SD乳鼠，70％酒精消毒后無(wú)菌環(huán)境

5、下取出心室，并用膠原酶消化，并用差速離心三次分離心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞兩天后，加入Brdu，再無(wú)血清環(huán)境下培養(yǎng)24h，分別加入苯腎上腺素與血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。
　?。ㄈz測(cè)miR-148a在肥大模型中的表達(dá)
　　用Trizol法常規(guī)提取大鼠心肌組織RNA和肥大心肌細(xì)胞RNA，定量后利用頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異引物反轉(zhuǎn)錄microRNA，并行定量PCR檢測(cè)，qRT-PCR使用SYRB GREENMIX試劑盒。

6、
　?。ㄋ模?gòu)建過(guò)表達(dá)腺病毒與miR-148a inhibitor
　　克隆相應(yīng)microRNA前體序列，并插入pADTrack-CMV穿梭質(zhì)粒，pmeⅠ線性化后轉(zhuǎn)化進(jìn)BJ5183感受態(tài)細(xì)菌，涂于卡那抗性LB板上過(guò)夜，Sganer測(cè)序篩選出正確的重組質(zhì)粒，并用lip2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293A細(xì)胞包裝病毒并擴(kuò)增，測(cè)定病毒滴度。在www.mirbase.org網(wǎng)站上檢索得到miR-148a的成熟序列，設(shè)計(jì)該序列的互補(bǔ)序列，對(duì)堿

7、基進(jìn)行2'甲氧修飾，其中合成和修飾序列由上海吉瑪公司完成。
　　（五）雙熒光素酶報(bào)告基因
　　生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其靶基因，將MAP3K4的mRNA3'UTR區(qū)插入熒光素酶質(zhì)粒中，再將質(zhì)粒與miRNA148a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，24h后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶表達(dá)量并定量分析。
　　（六）蛋白免疫印跡(western blot)
　　microRNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)原代心肌細(xì)胞，用RIPA裂解液提取蛋白

8、，行western blot檢測(cè)分析靶基因蛋白表達(dá)情況，常規(guī)100v電泳，75v、2h濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，并用5％牛奶封閉2h，4℃冰箱孵育一抗過(guò)夜。并用TBST反復(fù)洗滌三次，每次約15min，避光孵育二抗2h，TBST再次洗滌三次，用顯影液顯影，并在Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)中掃描蛋白條帶并分析，以進(jìn)一步確定miRNA-148a能否調(diào)控MAP3K4表達(dá)。
　?。ㄆ撸┙y(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方法表示，每組實(shí)

9、驗(yàn)重復(fù)至少3次，組件采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。我們默認(rèn)以P＜0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　（一）心肌肥厚模型的驗(yàn)證
　　1.SD大鼠心肌肥厚模型
　　腹主動(dòng)脈縮窄是最常見(jiàn)的大鼠心衰模型構(gòu)建方法之一，本次實(shí)驗(yàn)中24只實(shí)驗(yàn)大鼠均成功存活，部分實(shí)驗(yàn)組SD大鼠出現(xiàn)消瘦，毛發(fā)稀疏等跡象。腹主動(dòng)脈縮窄飼養(yǎng)4w的大鼠心臟外形明顯大于對(duì)照組;另外實(shí)驗(yàn)組大鼠ANP、myh7顯著升高，myh6則變化不明顯;心臟H

10、E染色切片有明顯的肥厚改變，表明模型構(gòu)建成功。
　　2.原代心肌細(xì)胞肥大模型
　　心肌細(xì)胞分離后分別經(jīng)過(guò)PE與AngⅡ刺激，并用α-actinin抗體標(biāo)記做免疫熒光染色，在共聚焦顯微鏡下細(xì)胞直徑和表面積都增加，細(xì)胞形態(tài)較為飽滿，同時(shí)定量PCR結(jié)果驗(yàn)證。
　?。ǘ﹎iRNA-148a在肥厚模型中表達(dá)降低
　　我們用定量PCR檢測(cè)了在miRNA-148a在心肌組織以及PE、AngⅡ內(nèi)的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在大鼠心肌肥

11、厚及AngⅡ誘導(dǎo)的肥大模型內(nèi)，miRNA-148a均表達(dá)下降，與既往的研究結(jié)果相符。
　　（三）過(guò)表達(dá)miR-148a促進(jìn)原代心肌細(xì)胞肥大
　　用miRNA-148過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞，48h后qRT-PCR檢測(cè)miRNA-148表達(dá)量，與對(duì)照組相比，結(jié)果提示升高13倍左右，提示轉(zhuǎn)染成功。檢測(cè)ANP、myh6、myh7表達(dá)情況，其中ANP，myh7有顯著升高，myh6無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示過(guò)表達(dá)miR-148a能促進(jìn)心肌

12、肥厚。
　?。ㄋ模┣玫蚼iR-148a可部分逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大
　　構(gòu)建miR-148a inhibitor并轉(zhuǎn)染PE誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞，定量PCR檢測(cè)miR-148a表達(dá)水平;結(jié)果提示miR-148a表達(dá)下降約60％，可有效抑制其表達(dá);同時(shí)其ANP表達(dá)水平比PE刺激組相比有明顯下降，但較基礎(chǔ)水平仍有升高;提示降低miR-148a表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大。
　?。ㄎ澹﹎iRNA-148a抑制MAP3K4的表達(dá)
　

13、　應(yīng)用TargetScan、microRNAorg等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索預(yù)測(cè)表明MAP3K4可能為miR-148a的潛在靶基因，故用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證，進(jìn)一步探討miR-148a調(diào)控心衰的潛在機(jī)制，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-148a能顯著抑制MAP3K4-3'UTR區(qū)熒光素酶表達(dá)，提示MAP3K4為miR-148a的靶基因。將過(guò)表達(dá)miR-148a過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)原代心肌細(xì)胞中，western blot結(jié)果顯示在MAP3K4蛋白表達(dá)水平明顯降低

14、，該結(jié)果同樣提示MAP3K4為miR-148a的靶基因。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　在成功構(gòu)建的大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型與心肌細(xì)胞肥大模型中，ANP、myh7顯著升高，myh6表達(dá)降低或無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)miRNA-148a表達(dá)降低。
　　在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miRNA-148a，能促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，同時(shí)心肌細(xì)胞中敲低miR-148a，則可部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞肥大。
　　miRNA-148a靶向作用于MAP3K4并能抑制該基因的表達(dá)