miR-199在心肌肥厚中的功能研究.pdf

1、心血管疾病是威脅人類健康的頭號殺手，心肌肥厚是多種心血管疾病共有的病理特征之一。它是指心臟對于各種機械應(yīng)力或者神經(jīng)激素刺激的一種代償性反應(yīng)，表現(xiàn)為心臟尺寸的增大和室壁的增厚。心肌肥厚的程度對于進(jìn)行性心臟疾病具有重要的預(yù)測作用并且與預(yù)后負(fù)相關(guān)，病理性心肌肥厚最終發(fā)展為心力衰竭是導(dǎo)致心肌肥厚患者死亡的主要原因。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多重要的參與調(diào)控心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的信號通路，但是其發(fā)生的分子機制還有待更加深入的研究。因此，研究發(fā)現(xiàn)新的心肌肥厚調(diào)控

2、基因，為心肌肥厚的治療尋找新的靶標(biāo)，對于預(yù)防和治療心臟疾病具有重要的意義。
　　病理性心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展往往伴隨著心臟穩(wěn)態(tài)的失衡，而近年來的研究表明自噬在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了極為重要的功能。自噬是指細(xì)胞自身的蛋白或者細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)包被形成自噬體，進(jìn)而與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最終溶解這些內(nèi)容物的過程。通過自噬可以實現(xiàn)細(xì)胞自身能量代謝及細(xì)胞器更新的需求，因此它是一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要生理過程。心肌細(xì)胞自噬的異常與心肌肥厚的發(fā)

3、生和發(fā)展密切相關(guān)，但是由于自噬功能的復(fù)雜性，利用遺傳修飾小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)不同的自噬功能基因在心肌肥厚中的功能是不同的，關(guān)于自噬究竟是促進(jìn)心肌肥厚還是抑制心肌肥厚這一問題還存在較大的爭議。
　　microRNA（miRNA）是一類長度大約為22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，廣泛地參與了各種重要的細(xì)胞生物學(xué)過程。它們可以與靶基因 mRNA3’非翻譯區(qū)以堿基互補配對的方式識別并結(jié)合，通過抑制蛋白的翻譯或促進(jìn) mRNA的降解兩種方式，對靶基

4、因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)。近年來國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一系列在心肌肥厚中發(fā)揮重要功能的miRNA，它們通過調(diào)節(jié)在心肌肥厚中重要的信號通路從而在心肌肥厚中起到有益或有害的作用。通過對這些miRNA的研究也發(fā)現(xiàn)了新的可能的心肌肥厚及心衰的臨床診斷指標(biāo)及治療靶標(biāo)。
　　miR-199a是一個重要的心肌細(xì)胞尺寸調(diào)控基因。之前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a在心衰病人標(biāo)本及病理性心肌肥厚小鼠模型中的表達(dá)均有顯著性的上調(diào)。體外研究結(jié)果顯示miR-199

5、a在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞尺寸及凋亡中發(fā)揮了重要的功能，但是關(guān)于miR-199a在小鼠體內(nèi)心臟穩(wěn)態(tài)維持中是否發(fā)揮功能以及相關(guān)的作用機制均未見報道。本研究旨在研究miR-199a的體內(nèi)功能，并探索其引發(fā)病理性心肌肥厚的分子機制。
　　我們首先在主動脈結(jié)扎引起的小鼠心肌肥厚模型及心衰病人標(biāo)本中驗證了miR-199a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均有顯著性的上調(diào)。為了研究miR-199a在體內(nèi)的功能，我們建立了心肌細(xì)胞特異性miR-199a過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，

6、發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了病理性心肌肥厚及心衰。分子機制研究顯示，miR-199a在體內(nèi)外過表達(dá)均可以激活自噬抑制因子mTOR，抑制心肌細(xì)胞自噬，并且這些生物學(xué)效應(yīng)是部分通過miR-199a的靶基因GSK3β所介導(dǎo)的。進(jìn)一步在體內(nèi)外分別通過雷帕霉素處理或者過表達(dá)Atg5激活自噬過程，發(fā)現(xiàn)可以挽救由miR-199a過表達(dá)所引起的心肌肥厚表型，這些結(jié)果證實miR-199a可以通過抑制心肌細(xì)胞自噬引起病理性心肌肥厚。
　　以上結(jié)果顯示，心肌細(xì)

7、胞特異性miR-199a過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠能夠自發(fā)的發(fā)生病理性心肌肥厚，而以往有文獻(xiàn)報道心肌細(xì)胞特異性miR-199b轉(zhuǎn)基因小鼠在壓力負(fù)荷下也更容易發(fā)生心肌肥厚，提示 miR-199家族是一個重要的心肌肥厚調(diào)控家族。然而這些研究都是基于體內(nèi)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的實驗證據(jù)，心肌細(xì)胞內(nèi)源的miR-199家族在心臟中發(fā)揮了怎樣的功能鮮見報道。為了進(jìn)一步研究內(nèi)源性miR-199在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能，我們建立了一種基于“miRNA sponge”策略

8、抑制內(nèi)源性miR-199功能的基因工程小鼠（miR-199-SP）。通過檢測發(fā)現(xiàn)miR-199a和miR-199b在miR-199-SP小鼠心臟組織中表達(dá)下調(diào)，而miR-199家族靶基因GSK3β、HIF1α和DYRK1A表達(dá)顯著上調(diào)，這些結(jié)果證明miR-199-SP小鼠心臟中miR-199家族的功能被有效抑制。對miR-199-SP轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)，三月齡轉(zhuǎn)基因小鼠開始出現(xiàn)心臟質(zhì)量增加，心肌細(xì)胞尺寸增大，但心肌肥厚的程度并不

9、隨著年齡增長更加顯著。心臟超聲結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能較對照小鼠無明顯異常。miR-199-SP小鼠心臟肥大標(biāo)志基因ANF表達(dá)顯著下調(diào)，BNP表達(dá)無明顯變化。Masson染色結(jié)果顯示miR-199-SP轉(zhuǎn)基因小鼠未發(fā)生纖維化等病理性重塑。分子機制研究顯示PGC1α是miR-199的靶基因，在miR-199-SP轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)升高，其調(diào)控的代謝基因上調(diào)可能是小鼠發(fā)生生理性心肌肥厚的機制之一。以上結(jié)果表明，miR-199-SP轉(zhuǎn)基因小鼠

10、發(fā)生了生理性心肌肥厚，提示內(nèi)源性miR-199家族在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了重要的功能。
　　最后，為了探索miR-199家族是否能夠成為心肌肥厚治療的靶標(biāo)，我們利用主動脈結(jié)扎術(shù)建立的病理性心肌肥厚小鼠模型進(jìn)行了治療實驗。通過鼠尾靜脈注射表達(dá)miR-199-SP序列的腺病毒后發(fā)現(xiàn)，抑制miR-199功能可以有效地緩解由于壓力型負(fù)荷增加引起的心肌細(xì)胞尺寸的增加、肥大標(biāo)志基因的上調(diào)和心臟功能的受損，這些結(jié)果表明抑制 miR-199可以有效

11、治療壓力型負(fù)荷引起心肌肥厚及心衰。
　　綜上所述，我們利用遺傳修飾的小鼠模型首次在體內(nèi)證實了miR-199家族在心肌肥厚及心臟穩(wěn)態(tài)維持中的重要功能。發(fā)現(xiàn)miR-199a過表達(dá)靶向調(diào)節(jié)GSK3β抑制心肌細(xì)胞自噬并引起病理性心肌肥厚，而抑制內(nèi)源性 miR-199家族引發(fā)生理性心肌肥厚，同時證明miR-199家族有可能成為心肌肥厚治療的新靶標(biāo)。該研究為理解心肌肥厚的發(fā)生機制提供了新的認(rèn)識，并為心肌肥厚的治療提供了新的理論基礎(chǔ)和實驗動物模