miR-34a與ATG9A在心肌肥厚中的作用.pdf

1、背景：心肌肥厚是以心室肌增厚，室腔變窄為主要特征改變。導(dǎo)致心肌肥厚最常見的病因是高血壓和心臟瓣膜狹窄。在細(xì)胞水平，心肌肥厚通常是由于心肌細(xì)胞體積增大和細(xì)胞骨架出現(xiàn)重構(gòu)所致，而不是由心肌細(xì)胞增多引起。在分子水平，心肌肥厚主要表現(xiàn)為胎兒基因表達(dá)增加。在生理情況下，心肌肥厚是心臟對壓力負(fù)荷的適應(yīng)性反應(yīng)。然而，心肌肥厚持續(xù)進(jìn)展往往導(dǎo)致不良的預(yù)后，最終會導(dǎo)致心衰和猝死。到目前為止，心肌肥厚的病理生理機(jī)制仍不完全闡明，針對心肌肥厚的有效防治仍然比較

2、局限。先前的研究表明，壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚促發(fā)了心肌細(xì)胞的自噬反應(yīng)。此外，心肌細(xì)胞過度自噬會導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。雖然，在真核細(xì)胞中，細(xì)胞生理水平上的自噬是必要的，因?yàn)榧?xì)胞可以通過自噬反應(yīng)清除體內(nèi)有害的蛋白和細(xì)胞器進(jìn)而維持自體代謝平衡。自噬不足或者過度均會導(dǎo)致疾病的病理進(jìn)展。ATG9A是目前發(fā)現(xiàn)唯一完整的自噬泡膜蛋白，定位于自噬泡膜/自噬前體中，是自噬發(fā)生過程中的必須蛋白。另外，miRNAs是生物體內(nèi)一類非編碼小分子 RNAs，能靶向結(jié)

3、合基因3’-UTR互補(bǔ)的種子序列，在轉(zhuǎn)錄水平參與了基因表達(dá)的調(diào)控。要么分解mRNA，要么抑制相關(guān)基因蛋白的表達(dá)。miRNAs異常改變與心肌肥厚的進(jìn)展相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)， miRNAs在心臟的生長和生理起到重要的作用。例如，miR-34a是一個多功能調(diào)控子，通過調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，涉及對細(xì)胞分裂、衰老、凋亡和增殖的調(diào)控。Cheng等人通過基因芯片技術(shù)證實(shí) miR-34a在小鼠肥厚的心臟組織中，其表達(dá)是失調(diào)控。但是，對于 miR-34a

4、如何調(diào)控心肌肥厚的機(jī)制仍不清楚。有實(shí)驗(yàn)證實(shí) miR-34a通過抑制 ATG9A介導(dǎo)的自噬活性，進(jìn)而調(diào)控漂亮新桿線蟲的生長周期。我們也知道，血管緊張素 II（AngiotensinII，AngII）是重要的生長因子，可介導(dǎo)心肌肥厚；其受體能調(diào)控心肌細(xì)胞的自噬活性。但是，仍不知道這些因子是否能在一起協(xié)同調(diào)控心肌肥厚？在 AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中，ATG9A介導(dǎo)的自噬活性是否過度激活？同時，miR-34a能調(diào)控AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥

5、大是否通過抑制ATG9A的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)？為此，我們設(shè)想：miR-34a表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致ATG9A表達(dá)的增加，介導(dǎo)了心肌細(xì)胞自噬的過度激活，進(jìn)而促進(jìn)了心肌細(xì)胞肥大。本研究首先擬建立大鼠心臟肥厚模型，探測肥厚心臟組織中miR-34a和ATG9A表達(dá)以及自噬活性的變化，以闡明心肌肥厚中miR-34a與ATG9A以及自噬活性變化的關(guān)系。其次，通過建立體外心肌細(xì)胞肥大模型，研究miR-34a對靶基因ATG9A的調(diào)控變化，以及其改變在AngII誘導(dǎo)的心

6、肌細(xì)胞肥大中的作用，進(jìn)一步闡明miR-34a是通過靶向于ATG9A來調(diào)控自噬活性從而參與心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生發(fā)展。我們希望通過明確這些新發(fā)現(xiàn)來幫助我們進(jìn)一步了解心肌肥厚的分子機(jī)制，從而為未來針對心肌肥厚的防治提供有希望的作用靶點(diǎn)。本研究分為三個部分：
　　第一部分：大鼠肥厚心臟組織中自噬活性和ATG9A、miR-34a的改變。
　　目的：探測壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚的心臟組織中自噬活性、ATG9A和miR-34a的改變。

7、r>　　方法：通過對SD大鼠進(jìn)行跨腹主動脈進(jìn)行縮窄（TAAC）來構(gòu)建心臟肥厚模型。經(jīng)超聲心動圖測量室壁厚度和組織切片HE染色等明確造模成功。組織miR-34a和ATG9A的表達(dá)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR，q-PCR）檢測；自噬相關(guān)蛋白（ATG9A、p62和LC3 II/I）用蛋白印跡（Western blot）進(jìn)行檢測，而心臟組織自噬泡的改變用透射電鏡來觀察。
　　結(jié)果：⑴術(shù)后4周，多普勒超聲心動圖探測

8、大鼠左室壁和腹主動脈。與假手術(shù)組大鼠比較，手術(shù)組大鼠左心室后壁收縮和舒張末期厚度（LVPWs和LVPWd）、室間隔收縮和舒張末期厚度（IVSs和IVSd）均明顯增加；頻譜多普勒顯示：腹主動脈縮窄處血流充盈缺損、血流速度增快，壓力階差增高。⑵與假手術(shù)組大鼠相比較，手術(shù)組大鼠大體心臟組織矢狀切片HE染色示：室壁增厚，乳頭肌和肉柱增粗。同時，心臟體重指數(shù)（HWI）增加。⑶與假手術(shù)組大鼠相比較，手術(shù)組大鼠心臟組織局部切片HE染色示：心肌細(xì)胞增大

9、、染色不均、著色淺，無核區(qū)多，肌纖維萎縮區(qū)域細(xì)胞核密度增加。Image Pro Plus軟件測量心肌細(xì)胞表面積明顯增大。⑷與假手術(shù)組大鼠比較，手術(shù)組大鼠心臟ATG9A表達(dá)明顯增加。⑸與假手術(shù)組大鼠比較，手術(shù)組大鼠心臟自噬活性標(biāo)記蛋白LC3II/I表達(dá)上調(diào)，而p62表達(dá)下調(diào)，同時自噬泡明顯增多。⑹與假手術(shù)組大鼠比較，手術(shù)組大鼠心臟組織miR-34a表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：①大鼠肥厚心臟組織自噬相關(guān)蛋白ATG9A表達(dá)上調(diào)和自噬活性增高。

10、②大鼠肥厚心臟組織miR-34a表達(dá)下調(diào)。
　　第二部分：ATG9A與自噬活性的變化在AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用。
　　目的：明確ATG9A與自噬活性的變化關(guān)系，以及它們在AngII刺激導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大中的作用。
　　方法：大鼠原代心肌細(xì)胞給予1μmol/LAngII刺激構(gòu)建體外心肌細(xì)胞肥大模型。分別觀察RNAi ATG9A和過表達(dá)ATG9A對心肌細(xì)胞自噬活性的影響。自噬活性通過Western blot檢測自噬

11、活性標(biāo)志蛋白p62和LC3II/I的表達(dá)、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞自噬發(fā)生率和透射電鏡觀察心肌細(xì)胞自噬泡數(shù)量來評價；同時，用qRT-PCR檢測肥厚基因表達(dá)和激光共聚焦觀察心肌細(xì)胞形態(tài)的變化來評價心肌細(xì)胞肥大的改變。
　　結(jié)果：⑴與對照組比較，原代心肌細(xì)胞給予AngII刺激組ATG9A表達(dá)明顯上調(diào)的同時，肥厚相關(guān)基因β-MHC和ANP的表達(dá)也明顯上調(diào)和細(xì)胞表面積增大。⑵與對照組比較，AngII刺激組心肌細(xì)胞自噬活性標(biāo)記蛋白LC3II/I表

12、達(dá)上調(diào)，而p62表達(dá)下調(diào)。⑶與對照組比較，AngII刺激組心肌細(xì)胞自噬率增加、自噬泡數(shù)量增多。⑷與空載體組比較，過表達(dá)ATG9A組心肌細(xì)胞ATG9A的表達(dá)明顯上調(diào)的同時，自噬活性標(biāo)記蛋白LC3II/I表達(dá)上調(diào)，而p62表達(dá)下調(diào)。⑸與陰性對照病毒組比較，陰性對照病毒+AngII組心肌細(xì)胞ATG9A的表達(dá)明顯上調(diào)的同時，自噬活性標(biāo)記蛋白LC3II/I表達(dá)上調(diào)，而p62表達(dá)下調(diào)。⑹與陰性病毒+AngII組比較，ATG9A干擾病毒+AngII組

13、心肌細(xì)胞ATG9A表達(dá)下調(diào)，自噬活性標(biāo)記蛋白LC3II/I表達(dá)下調(diào)，而p62表達(dá)上調(diào)。⑺與空載體組比較，過表達(dá)ATG9A組心肌細(xì)胞ATG9A的表達(dá)明顯上調(diào)的同時，心肌細(xì)胞自噬率增加、自噬泡數(shù)量增多。⑻與陰性對照病毒組比較，陰性對照病毒+AngII組心肌細(xì)胞自噬率增加、自噬泡數(shù)量增多。⑼與陰性病毒+AngII組比較，ATG9A干擾病毒+AngII組心肌細(xì)胞自噬率下降、自噬泡數(shù)量減少。⑽與空載體組比較，過表達(dá) ATG9A組心肌細(xì)胞肥厚相關(guān)基

14、因表達(dá)增加的同時，心肌細(xì)胞表面積增大。⑾與陰性對照病毒組比較，陰性對照病毒+AngII組心肌細(xì)胞肥厚相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)的同時，心肌細(xì)胞表面積增大。⑿與陰性病毒+AngII組比較，ATG9A干擾病毒+AngII組心肌細(xì)胞肥厚相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)的同時，心肌細(xì)胞表面積減少。
　　結(jié)論：①10-6mol/L AngII可刺激心肌細(xì)胞肥大，誘導(dǎo)ATG9A的表達(dá)和自噬活性的增加。②過表達(dá)ATG9A可促進(jìn)心肌細(xì)胞的自噬活性增加和肥大加劇。③干擾AT

15、G9A的表達(dá)能減輕AngII介導(dǎo)心肌細(xì)胞的自噬活性增加和肥大加劇。
　　第三部分：miR-34a與ATG9A的關(guān)系在AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用。
　　目的：研究在心肌細(xì)胞中，miR-34a能否調(diào)控ATG9A介導(dǎo)的自噬活性而調(diào)控心肌細(xì)胞肥大。
　　方法：心肌細(xì)胞感染miR-34a過表達(dá)或抑制病毒后，共轉(zhuǎn)染攜帶ATG9A3’-UTR的熒光素酶基因載體與內(nèi)參載體，熒光素酶儀器檢測熒光素酶活性的改變。同時，對miR-3

16、4a過表達(dá)或者抑制后，qRT-PCR和Western blot分別檢測心肌細(xì)胞ATG9A基因與蛋白的表達(dá)變化。用qRT-PCR探測AngII刺激后心肌細(xì)胞miR-34a和肥厚相關(guān)基因表達(dá)的變化，而心肌細(xì)胞大小的變化用激光共聚焦進(jìn)行觀察。通過miR-34a過表達(dá)或者抑制，觀察心肌細(xì)胞肥厚相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞大少及心肌自噬活性的變化。
　　結(jié)果：⑴與陰性病毒對照組比較，轉(zhuǎn)染pGL3-ATG9A3’-UTR-Wild Type時，過表達(dá)m

17、iR-34a，熒光素酶活性下降了45％；抑制miR-34a表達(dá)，熒光素酶活性升高了0.38倍。⑵與陰性病毒對照組比較，轉(zhuǎn)染pGL3-ATG9A3’-UTR-Mutant Type時，過表達(dá)miR-34a或抑制miR-34a表達(dá)，熒光素酶活性無明顯變化。⑶與陰性病毒對照組比較，過表達(dá)miR-34a組或抑制miR-34a組，ATG9A mRNA表達(dá)無變化；然而，ATG9A的蛋白分別下調(diào)到0.62倍和上升到1.7倍。⑷與陰性病毒組比較， An

18、gII+陰性病毒組心肌細(xì)胞自噬率明顯上調(diào)（11.27±0.61 vs22.27±0.75，P<0.05）。⑸與AngII+陰性病毒組比較，AngII+miR-34a過表達(dá)組心肌細(xì)胞自噬率明顯下降（22.27±0.75vs12.47±0.35，P<0.05）。⑹與陰性病毒組比較， AngII+陰性病毒組心肌細(xì)胞自噬泡數(shù)量明顯增加（0.9±0.1 vs2.4±0.31，P<0.05）。⑺與AngII+陰性病毒組比較，AngII+miR-34

19、a過表達(dá)組心肌細(xì)胞自噬泡數(shù)量明顯減少（2.4±0.31 vs1.62±0.4，P<0.05）。⑻與陰性病毒組比較，AngII+陰性病毒組心肌細(xì)胞肥厚相關(guān)基因 ANP和β-MHC表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞表面積增加。⑼與AngII+陰性病毒組比較，AngII+miR-34a過表達(dá)組心肌細(xì)胞肥厚相關(guān)基因ANP和β-MHC表達(dá)下調(diào)，心肌細(xì)胞表面積減少。然而，與AngII+miR-34a干擾組比較，肥厚基因ANP和β-MHC表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞表面積增加