可食用資源家蠶的核型多角體病毒抗性基因的高通量分子標(biāo)記篩選、定位及相關(guān)基因功能.pdf

1、家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)和模式昆蟲，也是一種重要的可食用資源。隨著人們生活水平的提高，家蠶這種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)脂肪資源逐漸得到重視，開始出現(xiàn)規(guī)模化的利用家蠶或蠶蛹作原料的功能食品生產(chǎn)，這也對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)提出了新的要求。在蠶業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常遇到一種病毒病的危害，即家蠶核型多角體病毒病(Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV)，每年能對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害，約占整個(gè)蠶病損失60％以上，在我國夏秋蠶期以及印度等養(yǎng)蠶國家尤為嚴(yán)

2、重，該蠶病目前在世界上還停留在預(yù)防階段。最新的一些研究表明這種桿狀病毒能夠進(jìn)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，這對(duì)家蠶作為可食用資源的開發(fā)和利用帶來一定潛在的威脅。所以無論在食用、生產(chǎn)還是安全方面考慮，對(duì)于家蠶核型多角體病毒病抗病基因的尋找和抗性機(jī)制的闡明都是一項(xiàng)重要的工作。本課題組從340個(gè)家蠶品種資源中鑒定出一種抗性資源，通過組配家蠶遺傳模型，從DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行過抗性基因篩選工作，取得一些進(jìn)展，但到目前為止，沒有獲得抗性基因。

3、　　本研究通過第二代高通量測序技術(shù)與群組分離分析相結(jié)合的方法對(duì)BmNPV抗性基因分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選和連鎖分析，最終將抗性基因初步定位，并對(duì)抗性基因候選區(qū)域進(jìn)行了分析獲得了候選抗性基因，并對(duì)一個(gè)可能參與抗病毒過程的基因V-ATPase進(jìn)行了進(jìn)一步分析。
　　本研究主要結(jié)果如下:
　　1.通過第二代高通量測序技術(shù)對(duì)BmNPV抗性品系NB和感性品系306親本進(jìn)行簡化基因組測序，一共獲得62185個(gè)標(biāo)記，對(duì)這62185個(gè)標(biāo)記根據(jù)親本

4、基因型關(guān)系進(jìn)行多態(tài)性分析，最終獲得5441個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，其中單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)4765個(gè)，酶切位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(EPSNP)355個(gè)和插入缺失突變標(biāo)記(INDEL)311個(gè)。
　　2.對(duì)于BmNPV抗性家蠶品系NB和感性品系306所具有的5441個(gè)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)有327個(gè)多態(tài)性標(biāo)記存在于基因編碼區(qū)內(nèi)，其中有138個(gè)為氨基酸水平的突變。通過COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)這些突變蛋白進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn)，感性

5、親本306涉及家蠶免疫的蛋白，如絲氨酸蛋白酶(BGIBMGA006406)，絲氨酸蛋白酶抑制劑(BGIBMGA013848)，胰凝乳蛋白酶(BGIBMGA008242)和一種與人類HSP40/DnaJ同源的熱休克蛋白家族成員(BGIBMGA013135)，以及兩種與DNA復(fù)制修復(fù)相關(guān)蛋白(BGIBMGA001493，BGIBMGA003650)發(fā)生了突變，提示306家蠶品系對(duì)于各種病原微生物與環(huán)境的敏感性很可能與其免疫系統(tǒng)的先天缺失有關(guān)

6、。
　　3.對(duì)NB和306回交群體BC1按抗感性進(jìn)行分組，各取40只提取DNA進(jìn)行混池測序分析，并對(duì)篩選到的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，最終發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與抗性性狀緊密連鎖的標(biāo)記，并將抗性基因定位在了家蠶第23號(hào)染色體一段0.67 Mb的區(qū)域。對(duì)于抗性基因緊密連鎖區(qū)域的分析發(fā)現(xiàn)含有22個(gè)預(yù)測基因，對(duì)這22個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)只有6個(gè)能在家蠶中腸表達(dá)，克隆測序結(jié)果表明其中有2個(gè)酯酶基因發(fā)生突變，功能預(yù)測表明很有可能為BmNPV抗性