藤茶中抗氧化活性物質(zhì)的提取及其二氫楊梅素生理活性分析.pdf

1、藤茶系我國南方特有茶、藥兩用植物，富含二氫楊梅素等黃酮類化合物，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤和降血脂活性，值得深入研究。本文建立五個抗氧化活性評價(jià)指標(biāo)，用以評價(jià)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化的藤茶中抗氧化活性物質(zhì)的超聲強(qiáng)化提取工藝，并采用超聲輔助雙水相提取方法優(yōu)化藤茶中指標(biāo)性成分——二氫楊梅素的提取工藝;系統(tǒng)分析了二氫楊梅素體內(nèi)外抗氧化及抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，并探討了過渡金屬Cu2+在二氫楊梅素抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖中的作用:二氫楊梅素-Cu2+體系

2、的促氧化活性是誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制。研究結(jié)果為藤茶在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)藤茶中抗氧化活性物質(zhì)的提取以總多酚、二氫楊梅素得率，F(xiàn)e2+、Trolox當(dāng)量為指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，確定了對抗氧化活性指標(biāo)影響顯著的三個因素（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲提取溫度和提取時(shí)間），建立了抗氧化指標(biāo)與三個因素間的數(shù)學(xué)模型，并得出藤茶中抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)67％～

3、68％，超聲提取溫度45～48℃，時(shí)間27～28min，料液比25mL·g-1。在此優(yōu)化工藝下藤茶多酚得率為358.4±4.9mg·g-1，二氫楊梅素得率315.6±6.2mg·g-1，F(xiàn)e2+當(dāng)量為570.6±7.8μmol·g-1，Trolox當(dāng)量為14.9±0.55mmol·g-1(ABTS法)和12.1±0.68mmol·g-1(DPPH法)。
　　(2)藤茶中二氫楊梅素的雙水相提取及富集建立硫酸銨-乙醇雙水相超聲輔助提取

4、體系用于藤茶中二氫楊梅素的提取。通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法，得出二氫楊梅素的最佳提取工藝參數(shù)為:硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.96％，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.84％，提取溫度51℃，二氫楊梅素得率為360.4±5.8mg·g-1;硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.30％，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)23.08％，提取溫度50℃，二氫楊梅素在兩相間的分配系數(shù)為18.9±1.1。首次嘗試制備富氮多孔磁性納米材料N-g-C3N4-MnFe2O4用于雙水相下相殘留二氫楊梅素的富集，獲得了

5、初步富集工藝:在初始二氫楊梅素濃度20μg·g-1，pH5.5，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0％，萃取溫度為25℃條件下，N-g-C3N4-MnFe2O4對二氫楊梅素吸附量可達(dá)到5.36mg·g-1，通過一次萃取，可富集75.4％的二氫楊梅素，顯現(xiàn)了一定的應(yīng)用價(jià)值。
　　(3)二氫楊梅素體內(nèi)外抗氧化活性分析采用體外試驗(yàn)方法，對二氫楊梅素在生理性羥基、亞硝基和超氧陰離子自由基清除，非生理性DPPH、ABTS·+、DMPD·+自由基清除，總抗氧

6、化能力、還原能力以及對過渡金屬離子還原、螯合等方面的抗氧化活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果顯示:二氫楊梅素具有很強(qiáng)的抗氧化活性，并呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，其抗氧化能力相當(dāng)或略低于陽性對照Vc，但對金屬離子的螯合能力較弱。采用D-半乳糖所致小鼠衰老模型，分析了二氫楊梅素對衰老模小鼠體內(nèi)各抗氧化活性酶表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示:二氫楊梅素能夠劑量依賴性地提高衰老小鼠各臟器指數(shù)，提高衰老小鼠體內(nèi)各抗氧化酶表達(dá)水平，降低脂質(zhì)過氧化水平。
　　(4)

7、二氫楊梅素體外抗腫瘤活性研究了二氫楊梅素對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性，結(jié)果顯示:二氫楊梅素對結(jié)腸癌HCT116和肝癌HepG2兩種腫瘤細(xì)胞的抑制活性較強(qiáng)，對肺癌A549細(xì)胞抑制活性較弱。二氫楊梅素對HepG2腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)劑量-時(shí)間-依賴性抑制活性，Cu2+能夠增強(qiáng)二氫楊梅素的抗HepG2活性。進(jìn)一步采用Hoechst33342染色、AnnexinⅤ/PI雙染色、DCFH-DA探針、Western Blot等方法對二氫楊梅素作用后的HepG2

8、腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)ROS水平及凋亡蛋白表達(dá)等的分析。結(jié)果顯示，二氫楊梅素-Cu2+體系促氧化作用產(chǎn)生的活性氧能經(jīng)由線粒體途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。建立了二氫楊梅素-Cu2+體系體外促氧化活性分析方法，揭示了在酸性條件下二氫楊梅素更容易將Cu2+還原為Cu+，進(jìn)而產(chǎn)生羥基自由基將DNA和蛋白質(zhì)氧化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于揭示二氫楊梅素促氧化活性抗腫瘤作用機(jī)制以及開發(fā)研制新型高效、低毒的抗腫瘤保健食品與藥