白念珠菌高鐵還原酶基因表達(dá)調(diào)控及Aft2p轉(zhuǎn)錄因子的功能研究.pdf

1、白念珠菌是最常見的條件性致病菌,由白念珠菌引起的感染逐年上升,引起人們廣泛的關(guān)注。白念珠菌細(xì)胞形態(tài)從酵母型向菌絲型的轉(zhuǎn)換與其感染能力和毒力密切相關(guān)。細(xì)胞對(duì)外界pH的應(yīng)答是由保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑RIM101途徑所控制,白念珠菌中許多依賴pH表達(dá)的基因受轉(zhuǎn)錄因子Rim101蛋白的調(diào)控。pH條件影響著鐵離子的生物可利用率,由此推測(cè)鐵吸收系統(tǒng)受轉(zhuǎn)錄因子Rim101蛋白調(diào)控。鐵離子的吸收是白念珠菌在宿主中定居、存活和致病過(guò)程中重要的影響因素。鐵吸收

2、系統(tǒng)的調(diào)控對(duì)白念珠菌生存起非常重要的作用,其中高鐵還原酶是高親和性吸收系統(tǒng)的第一個(gè)關(guān)鍵酶,高鐵還原酶基因表達(dá)的開啟與關(guān)閉將直接影響白念珠菌吸收鐵離子的能力。白念珠菌基因中含有17個(gè)編碼高鐵還原酶的基因,因此研究這些基因的表達(dá)調(diào)控,通過(guò)構(gòu)建基因缺失突變株分析基因的功能,發(fā)現(xiàn)與形態(tài)轉(zhuǎn)換相關(guān)的新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等有助于更加深入的了解白念珠菌是如何在宿主中(低鐵環(huán)境)存活的,而且本研究所鑒定與識(shí)別的靶點(diǎn)將為白念珠菌的感染治療和藥物開發(fā)提供重要的理

3、論依據(jù)。
　　 首先,通過(guò)Northern雜交的方法檢測(cè)高鐵還原酶基因FRE1,FRE2,FRE10,FRE11,FRP1和FRP2在酸性(pH4)和堿性(pH8)培養(yǎng)條件下,以及在酸性和堿性的培養(yǎng)基中分別添加50μmol/L BPS,1.50μmol/L BIP和150μmol/L菲洛嗪(Fetrozine)鐵離子螯合劑所造成低鐵環(huán)境中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FRE10為酸性pH應(yīng)答基因；FRE1、FRE2、FRE11和FRP2為

4、堿性應(yīng)答基因；FRP1的表達(dá)較為特殊:既是堿性應(yīng)答基因,又是低鐵條件應(yīng)答基因。
　　 然后,利用PCR介導(dǎo)的同源重組的方法構(gòu)建了白念珠菌高鐵還原酶fre1△/△、fre2△/△、fre5△/△、fre10△/△和frp1△/△單基因缺失突變株以及fre1△/△fre2△/△、fre2△/△fre10△/△兩株雙基因突變株,并對(duì)上述基因缺失突變株和實(shí)驗(yàn)室保存的缺失突變株的細(xì)胞高鐵還原酶活性進(jìn)行分析,結(jié)果表明在酸性條件下(pH4),

5、fre10△/△以及含有fre10突變的fre2△/△fre10△/△和fre5△/△fre10△/△雙基因突變株都導(dǎo)致高鐵還原酶活性大大降低,說(shuō)明Fre10p是酸性條件下高鐵還原酶活性的主要貢獻(xiàn)者；堿性條件下(pH8),fre2△/△以及含有fre2突變的fre2△/△fre10△/△和fre1△/△fre2△/△雙基因突變株都導(dǎo)致高鐵還原酶活性大大降低,說(shuō)明Fre2p是堿性條件下高鐵還原酶活性的主要貢獻(xiàn)者；而其它基因例如fre1、f

6、re5、fre8、fre9、fre71、frp1和frp2基因的缺失突變不影響菌株在pH4、pH4+50μmol/L BPS和pH8培養(yǎng)條件下高鐵還原酶的活性。
　　 通過(guò)對(duì)已獲得的高鐵還原酶基因缺失突變株在低鐵條件下生長(zhǎng)情況的比較發(fā)現(xiàn):在YPG培養(yǎng)基中所有菌株都生長(zhǎng)良好,而在YPG+150μmol/L,BPS的低鐵培養(yǎng)基中,只有fre2△/△突變株不能生長(zhǎng),在YPG+200μmol/L BPS的低鐵培養(yǎng)基中,fre2△/△和f

7、rp1△/△突變株都不能生長(zhǎng),這說(shuō)明在較低濃度的鐵環(huán)境下Fre2p是吸收鐵離子的主要高鐵還原酶,但是在更低濃度的鐵離子環(huán)境中,Fre2p和Frp1p對(duì)菌株的生長(zhǎng)同等重要,二者缺少任何一個(gè)都將導(dǎo)致菌株對(duì)低鐵環(huán)境敏感。
　　 構(gòu)建高鐵還原酶FRP1基因啟動(dòng)子與lacZ基因的融合結(jié)構(gòu)(PFRP1-lacZ),并將PFRP1-lacZ分別轉(zhuǎn)入野生型和rim101△/△菌株中,結(jié)果表明Rim101p轉(zhuǎn)錄因子的缺失嚴(yán)重降低了FRP1基因啟動(dòng)

8、子的活性。在野生型菌株中,酸性條件只能較低程度上誘導(dǎo)FRP1基因啟動(dòng)子的活性；堿性條件可以明顯促進(jìn)FRP1基因啟動(dòng)子的活性,而且這種促進(jìn)作用依賴于低鐵環(huán)境。
　　 通過(guò)對(duì)已經(jīng)克隆得到的982bp的FRP1基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)可能的Rim101p結(jié)合序列,分別位于-629位點(diǎn)和-157位點(diǎn)。通過(guò)電泳遷移率實(shí)驗(yàn)確定Rim101p能夠與FRP1啟動(dòng)子內(nèi)部的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合,再通過(guò)定點(diǎn)突變的方法,構(gòu)建含有Rim1

9、01p結(jié)合序列突變的FRP1基因啟動(dòng)子P-157mut、P-629mut和P-157,-629mut,并檢測(cè)含有突變啟動(dòng)子菌株的β-半乳糖苷酶的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn):-157位點(diǎn)的突變并沒有改變啟動(dòng)子的活性,與含有P-lacZ結(jié)構(gòu)的菌株的活性相似；但是-629位點(diǎn)的突變?cè)斐删甑膌acZ活性比野生型降低了6倍,這表明-629位點(diǎn)在Rim101p調(diào)控FRP1表達(dá)的過(guò)程中起著非常重要的作用,而-157位點(diǎn)對(duì)于基因的表達(dá)調(diào)控并不重要。
　　

10、 利用同源重組的方法,構(gòu)建含有FRP1:GFP融合結(jié)構(gòu)的菌株,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),并且可以清楚地發(fā)現(xiàn)Frp1蛋白定位于細(xì)胞的液泡中,通過(guò)軟件分析表明Frp1p是一個(gè)具有5次跨膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白,因此可以得知白念珠菌Frp1p定位于液泡膜。
　　 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)了白念珠菌Aft類型的轉(zhuǎn)錄因子Aft2p,并將AFT2基因在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaAFT2基因在釀酒酵母PGK1強(qiáng)啟動(dòng)子的誘導(dǎo)下能夠彌補(bǔ)

11、Scaft1△菌株的生長(zhǎng)缺陷,這說(shuō)明白念珠菌Aft2p轉(zhuǎn)錄因子與釀酒酵母Aft類型的轉(zhuǎn)錄因子具有功能相似性。同時(shí)構(gòu)建白念珠菌aft2△/△缺失突變株和AFT2基因的回補(bǔ)突變株并進(jìn)行表型分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)棚的缺失不影響菌株在液體和固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng),但是基因突變改變了菌落的形態(tài),缺失突變株在固體培養(yǎng)基中不能形成菌絲,同時(shí)aft2的缺失對(duì)細(xì)胞高鐵還原酶活性產(chǎn)生較大影響,而且以小鼠為模型的系統(tǒng)感染實(shí)驗(yàn)表明白念珠菌aft2基因的缺失在較大程度上減弱