白念珠菌鈣通路基因表達(dá)調(diào)控及CCS途徑的功能研究.pdf

1、白念珠菌（Candida albicans）是醫(yī)院獲得性真菌病的主要感染源之一，也是深部真菌感染的首要病原菌，引起的致死率可達(dá)38％-49%。白念珠菌能適應(yīng)不同環(huán)境變化的能力，尤其是在環(huán)境pH的應(yīng)答過程中獲得適應(yīng)性以及菌株自身發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)換的能力對其致病性至關(guān)重要，近年來在白念珠菌感染治療的過程中出現(xiàn)藥物耐受性的逐漸上升，獲得對藥物環(huán)境的適應(yīng)性，在某種程度上也是其發(fā)揮致病性的一種保證。白念珠菌逐漸進(jìn)化出多種復(fù)雜的信號途徑，借以獲得不同的環(huán)

2、境適應(yīng)性，鈣細(xì)胞存活(Calcium Cell Survival，CCS)途徑是酵母細(xì)胞中重要的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過Cchl-Midl鈣通道引發(fā)Ca2+內(nèi)流并借助鈣信號的傳遞，激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)和Crzlp來介導(dǎo)細(xì)胞存活。
　　 胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)平衡與酵母細(xì)胞的pH密切相關(guān)，而對外界pH的應(yīng)答是由保守的RIM101途徑所控制，由此推測由Ca2+介導(dǎo)、Crzlp調(diào)控的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和Rim101p調(diào)控的RIM101途徑

3、協(xié)同參與這個應(yīng)答。然而細(xì)胞中Ca2+信號的多樣性決定了細(xì)胞中必然會有大量的信使和通路的存在，借助于此引發(fā)Ca2+濃度的變化。因此研究Crzlp和Riml01p在堿性pH條件下對這些鈣通路基因的表達(dá)調(diào)控，通過構(gòu)建鈣通路基因缺失菌株對白念珠菌Ca2+刺激激活相關(guān)的鈣通路基因功能的研究，來鑒定經(jīng)Cchlp-Midlp的Ca2+流入介導(dǎo)的CCS途徑在堿性pH壓力應(yīng)答中的重要作用；研究CCS途徑對白念珠菌毒力和致病性的調(diào)控以及對藥物耐受性的影響，

4、將獲得這種在醫(yī)學(xué)上極為重要的病原菌是如何利用CCS途徑在宿主中存活的依據(jù)，本研究所鑒定與識別的藥物新靶點(diǎn)也將為臨床上白念珠菌感染的介入治療開辟新的途徑。
　　 首先，通過熒光定量PCR進(jìn)行相對定量分析，比較鈣通路基因CCH1、MID1、PMR1和YVC1在酸性(pH4)和堿性(pH8)培養(yǎng)條件，以及在酸堿環(huán)境分別添加20mmol/L Ca+和5mmol/L EGTA所造成的酸性富鈣和堿性缺鈣條件下的表達(dá)差異，結(jié)果表明CCH1和M

5、ID1在堿性和酸性富鈣的培養(yǎng)條件下表達(dá)量較高；堿性低鈣條件能夠刺激YVC1表達(dá)上調(diào)；而PMR1在除酸性以外的條件下都有較高表達(dá)量，說明CCH1、MID1、YVC1和PMR1均有可能參與在堿性pH應(yīng)答過程中Ca2+變化的調(diào)控。
　　 然后，利用二步法PCR介導(dǎo)的基因重組技術(shù)構(gòu)建了白念珠菌鈣通路相關(guān)基因缺失菌株cchl△/△、midl△/△、yvc△/△、pmrl△/△、cnal△/△和crzlA/△，并通過固體和液體培養(yǎng)方式，確定

6、了Ca2+對堿性pH條件下菌株的生長具有顯著影響，在較低Ca2+濃度的堿性環(huán)境中(pH8+5mmol/L EGTA+10mmol/L Ca2+)，Cchl和Mid1p在細(xì)胞獲得Ca2+的過程中起主要作用。
　　 利用FLUO-3AM熒光探針負(fù)載細(xì)胞和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合的方法，追蹤堿性pH刺激下白念珠菌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化以及不同缺失菌株對Ca2+波動變化的影響。結(jié)果表明，堿性pH條件能夠引起胞內(nèi)Ca2+濃度的瞬間升高，并且這種變

7、化在cchl△/△和midl△/△缺失菌株中消失；堿性pH刺激下胞內(nèi)Ca+濃度的瞬間波動變化不是液泡中貯存Ca2+的釋放，而主要來源于胞外環(huán)境中的Ca2+，由Cchl-Midl介導(dǎo)的胞外Ca2+內(nèi)流在這個過程中起主要作用；Crzlp和Rim101p也能夠?qū)A性pH刺激下的Ca2+波動變化產(chǎn)生影響。
　　 構(gòu)建嗜熱鏈霉菌（Streptomyces thermophilus）LacZ報告基因與白念珠菌堿性pH應(yīng)答基因PH089的融合

8、結(jié)構(gòu)(PPHO89-LacZ)，并將其分別轉(zhuǎn)化野生型菌株和缺失菌株cchl△/△、midl△/△、pmrl△/△及yvcl△//，測定結(jié)果顯示在cchl△/△和midl△/△菌株中，各種培養(yǎng)條件下LacZ活性都明顯低于野生型菌株，表明PH089基因啟動子的活性是Ca2+依賴性的，通過Cchl-Midl的Ca2+內(nèi)流對其應(yīng)答發(fā)揮著重要調(diào)控作用。將pDDB78-PeHO89-lacZ質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化crzl△/△和riml01A/△缺失菌株，

9、確定堿性pH應(yīng)答基因PH089的啟動子活性受到Crzlp和Riml01p的影響，并且Crzlp對啟動子活性的調(diào)控作用更為明顯。
　　 熒光定量PCR的結(jié)果表明，Crzlp和Riml01p對鈣通路基因表達(dá)的調(diào)控作用是pH依賴性的，在堿性pH條件下，CCH1和MIDl更易受到Crzlp和Riml01p的影響，但Crzlp對其的調(diào)控作用是非CaN依賴性的。構(gòu)建CCH1和MIDl基因啟動子與lacZ基因的融合質(zhì)粒pDDB78-PccH1

10、-lacZ和pDDB78-PMml-lacZ，分別轉(zhuǎn)入野生型菌株和缺失菌株riml01△/△及crzl△/△中，確定在堿性pH條件下，CCH1和MIDl啟動子的活性主要受到Crzlp的影響。
　　 通過對已克隆得到的lkb的CCH1和MID1基因啟動子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)都存在可能的Crzlp結(jié)合位點(diǎn)，分別在CCHl-619位點(diǎn)和MIDl-874位點(diǎn)。電泳遷移率試驗(EMSA)證實Crzlp能夠與CCH1和MIDI基因啟動子內(nèi)部的

11、結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合，并且這種結(jié)合作用不受條件影響。利用定點(diǎn)突變分析方法，構(gòu)建P-619mut和P-874mut兩個分別含有CCHl-619和MIDl-874位點(diǎn)突變的啟動子序列與LacZ的融合結(jié)構(gòu)，并將其分別轉(zhuǎn)入野生型和crzl△/△菌株中，LacZ測定結(jié)果表明，CCHl-619和MIDl-874位點(diǎn)的Crzlp結(jié)合序列對于它們各自啟動子的活性非常重要，且Crzlp轉(zhuǎn)錄激活因子在調(diào)控CCH1和MIDl基因的表達(dá)方面起著重要作用。
　

12、　 通過對固體和液體菌絲發(fā)育的誘導(dǎo)、藥物平板敏感性試驗及倍比梯度稀釋法，對CCS途徑相關(guān)缺失菌株的表型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCH1和MIDl基因的缺失對白念珠菌菌絲的正常生長有延遲作用，但并不能完全抑制菌絲生成；cchl△/△和midl△/△菌株對50mmolH202和lmmol/L或400μmol/L甲萘醌表現(xiàn)出敏感性，CCH1和MIDl基因的回補(bǔ)都能夠彌補(bǔ)缺陷表型；缺失菌株cnal△/△、cchl△//和midl△/△對20℃低溫

13、、10mmol/L Fe3+、2%山梨醇和乙醇壓力表現(xiàn)出敏感性，但是菌株能夠耐受37℃高溫，并能夠利用2%的半乳糖或是2%的山梨醇作為碳源，這些結(jié)果都表明CCS途徑在菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)換和環(huán)境適應(yīng)性的獲得方面發(fā)揮著重要作用。小鼠系統(tǒng)感染模型的建立及菌落形成單位(CFU)計數(shù)分析的結(jié)果表明白念珠菌CCH1或MID1基因的缺失在較大程度上減弱了菌株的毒力，表明CCS途徑參與了白念珠菌致病性的調(diào)控作用。
　　 依照M27-A2方案的微量液基稀