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文檔簡介
1、樺褐孔菌Inonotus obliquus(Ach.exPers.) Pilát,是一種非常珍貴的藥用菌,菌核為主要藥用價(jià)值部位,其在抗腫瘤、抗高血壓、降血糖、提高免疫力等方面有顯著療效,一直深受人們的喜愛。然而樺褐孔菌野生資源十分稀少,且野生的樺褐孔菌在樺樹上要經(jīng)過10-15年才具有良好的藥用價(jià)值,因此樺褐孔菌人工栽培工作的探索迫在眉睫。目前樺褐孔菌菌核的栽培已取得成功,但產(chǎn)量較低,研究證明,胞外酶活性變化與菌核生長關(guān)系密切,繼而本試
2、驗(yàn)以樺褐孔菌JL01為試材,繼續(xù)在與菌核發(fā)育有關(guān)的胞外酶——纖維素酶的分子水平上展開研究,為進(jìn)一步了解胞外酶的蛋白質(zhì)功能和分泌表達(dá)變化規(guī)律,以及建立高效的外源表達(dá)載體提供理論依據(jù),具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
1.克隆并獲得了樺褐孔菌JL01菌株中內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase,IO-EG)和β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,IO-BGL)的ORF序列,β-葡萄糖苷酶的ORF序列與Gen bank中公布的ORF
3、序列完全吻合,而內(nèi)切葡聚糖酶的ORF序列與Gen bank中公布的ORF序列比對,發(fā)現(xiàn)1092個(gè)堿基T缺失,導(dǎo)致ORF序列改變,得到了新的內(nèi)切葡聚糖酶ORF序列,新基因命名為egⅠ,egⅠ的ORF序列全長為1149 bp,編碼382個(gè)氨基酸,推測的蛋白分子量為40.1 kDa,理論等電點(diǎn)為4.78,序列比對和功能分析鑒定后,確定其為纖維素酶糖苷水解酶第5家族;
2.構(gòu)建了樺褐孔菌內(nèi)切葡聚糖酶基因(egⅠ)和β-葡萄糖苷酶基因(
4、bgl)原核表達(dá)載體,并命名為pET-30a-egⅠ和pET-30a-bgl;
3.IO-EG和IO-BGL原核表達(dá)載體pET-30a-egⅠ和pET-30a-bgl正確導(dǎo)入大腸桿菌BL21中,并獲得穩(wěn)定表達(dá)的蛋白,SDS結(jié)果顯示蛋白均以包涵體形式存在,IO-EG和IO-BGL重組蛋白分子質(zhì)量分別約為40 kDa和90 kDa;
4.采用Ni-IDA蛋白純化試劑盒在變性條件下對目的蛋白進(jìn)行純化,純化后的IO-EG蛋白
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