普羅布考、西洛他唑?qū)Υ笫蠊撬柙葱詢?nèi)皮祖細(xì)胞功能活性影響的研究.pdf

1、目的：隨著研究的進(jìn)展，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的治療已經(jīng)取得顯著成效，單獨(dú)使用抗氧化、調(diào)脂及抗血小板治療已取得了良好效果，尤其是普羅布考（Probucol，丙丁酚）和西洛他唑(Cilotazol)為應(yīng)用廣泛的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物，臨床主要用于改善慢性動(dòng)脈閉塞癥引起的缺血性癥狀如潰瘍及間歇性跛行等。兩藥在抗動(dòng)脈粥樣硬化、防治血管形成術(shù)后再狹窄等心血管疾病的治療方面已經(jīng)越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注，其新的作用機(jī)制及應(yīng)用

2、正在被進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，存在于體內(nèi)多種組織。其中骨髓含量最為豐富，其能夠遷移并定向分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，EPCs不僅參與了胚胎時(shí)期原始血管網(wǎng)的形成，還參與了出生后血管的修復(fù)與新生。臨床前研究也證明EPCs能夠治療肢體缺血，心肌梗死等缺血性疾病，提示EPCs在治療AS中的潛在作用，并逐漸引起了人們的重視。<

3、br>　　 由于人體中EPCs含量較少，含量最豐富的骨髓中也僅占骨髓單個(gè)核細(xì)胞的1％。因此，在如AS等血管損傷性疾病的治療過(guò)程中，選擇恰當(dāng)?shù)闹委熓侄?，以提高EPCs含量和功能活性，來(lái)保證EPCs更加有效地實(shí)現(xiàn)血管損傷修復(fù)是本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。普羅布考和西洛他唑現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，是有效抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物，能夠作用于多種細(xì)胞，尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮其降脂、抗炎、抗氧化等作用，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，對(duì)于阻止缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展

4、具有重要意義。然而目前，有關(guān)普羅布考和西洛他唑?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞功能活性影響的研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)研究的主要目的是探討普羅布考和西洛他唑?qū)Υ笫蠊撬柙葱詢?nèi)皮祖細(xì)胞功能活性的影響，闡明普羅布考和西洛他唑影響下的內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)的血管新生作用的潛在機(jī)制，從而為AS等缺血性疾病的治療和新藥的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離及培養(yǎng)150-200gWistar大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。采用密度梯

5、度離心法從大鼠骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞，用含有10％胎牛血清的EGM-2MV內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行原代培養(yǎng)，置于5％CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。隔天換液一次，7-9天細(xì)胞呈單層密集生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為培養(yǎng)7天左右的原代細(xì)胞。
　　 二、大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定（一）形態(tài)學(xué)觀察:倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性。
　　 （二）TRICT-CD133和FITC-vWF雙重免疫熒光鑒定取培養(yǎng)第五天的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。一抗

6、為山羊抗大鼠CD133和兔抗大鼠vWF單克隆抗體，二抗分別為T(mén)RICT標(biāo)記的驢抗山羊和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG。
　　 三、實(shí)驗(yàn)分組
　　 分為對(duì)照組、普羅布考濃度組和西洛他唑濃度組。普羅布考濃度分別為0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L，西洛他唑濃度分別為0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L。
　　 四、內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性

7、的檢測(cè)消化收集貼壁細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，培養(yǎng)7天后以藥物作用24小時(shí)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)OD490值。
　　 五、內(nèi)皮祖細(xì)胞管腔形成的檢測(cè)4℃溶解Matrigel膠，將其加入24孔培養(yǎng)板中，孵箱孵育30min，將細(xì)胞懸液按1×104個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種于鋪滿Matrigel膠的24孔板上。以藥物作用24小時(shí)后，觀察各組細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)排列情況和完整程度，隨機(jī)選取管腔密集的視野

8、處計(jì)數(shù)并拍照。
　　 六、Real time RT-PCR檢測(cè)CD133和vWF mRNA表達(dá)水平收集藥物作用24小時(shí)后的EPCs，進(jìn)行RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，最后計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
　　 七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、EPCs的培養(yǎng)與鑒定原代培養(yǎng)2

9、4h后，細(xì)胞大部分呈小圓形;差速貼壁篩選后，培養(yǎng)1d可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁;4d后細(xì)胞開(kāi)始伸展成梭形或紡錘形;7d后集落中央為圓形細(xì)胞，外周細(xì)胞呈梭形，且生長(zhǎng)旺盛;大約10d至14d融合成單層，呈內(nèi)皮細(xì)胞典型的鋪路石樣形態(tài)。CD133、vWF標(biāo)記培養(yǎng)第五天的EPCs，可見(jiàn)雙熒光陽(yáng)性，表明其為正在分化的EPCs。
　　 二、普羅布考及西洛他唑?qū)PCs增殖的影響在培養(yǎng)的EPCs中分別加入不同濃度的普羅布考（0.3μmol/L、1.0μm

10、ol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L）或西洛他唑（0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L），作用24小時(shí)，MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度的普羅布考或西洛他唑均可以促進(jìn)EPCs的增殖，P值＜0.05。
　　 三、普羅布考及西洛他唑?qū)PCs管腔形成的影響在培養(yǎng)EPCs中分別加入不同濃度的普羅布考（0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.

11、0μmol/L）或西洛他唑（0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L），作用24小時(shí)，Matrigel管腔形成檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度的普羅布考或西洛他唑均可以促進(jìn)EPCs的管腔形成，P值＜0.05。
　　 四、普羅布考及西洛他唑?qū)PCs分化的影響在培養(yǎng)EPCs中分別加入不同濃度的普羅布考（0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L）或西

12、洛他唑（0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L），作用24小時(shí)，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)EPCs表面抗原CD133和vWF的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CD133表達(dá)減弱，vWF表達(dá)增加，P值＜0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1、普羅布考可以促進(jìn)培養(yǎng)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、管腔形成及分化能力。
　　 2、西洛他唑可以促進(jìn)培養(yǎng)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、管腔形