神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化調(diào)控效應(yīng)及其經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)性研究.pdf

1、本研究以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，探討神經(jīng)肽Y對(duì)其成骨分化以及BMP-2、VEGF等相關(guān)因子表達(dá)的影響，并從經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路角度探討其相關(guān)機(jī)制。本次研究將進(jìn)一步加深目前對(duì)神經(jīng)因素通過神經(jīng)肽調(diào)控骨折愈合的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，以及為其在骨折以及骨代謝疾病中的臨床應(yīng)用提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)主要的實(shí)驗(yàn)材料、方法、內(nèi)容和結(jié)論主要包括以下幾個(gè)部分:
　　總體研究目的：
　　1.神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠BMSCs成骨

2、分化的影響;
　　2.神經(jīng)肽Y在大鼠BMSCs成骨分化過程中BMP-2、VEGF表達(dá)的影響;
　　3.神經(jīng)肽Y調(diào)控大鼠BMSCs生物學(xué)效應(yīng)與其相關(guān)Wnt通路的初步探討。
　　第1部分 神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響
　　目的:
　　通過全骨髓貼壁法獲取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用流式鑒定法鑒定其純度，同時(shí)探討不同濃度神經(jīng)肽Y對(duì)BMSCs成骨分化的影響。
　　方法:
　　1.BMS

3、Cs細(xì)胞獲取、培養(yǎng)及鑒定
　　選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物80-100g左右的SD大鼠（雌雄不限），按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求采用頸椎脫臼法處死大鼠，于清潔條件無菌器械輔助下，逐層切開大鼠解剖結(jié)構(gòu)后獲取大鼠雙側(cè)的股骨及脛骨。使用注射器針頭沖洗骨髓腔直至骨髓腔兩端泛白，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（低糖）行全骨髓法分離培養(yǎng)BMSCs。培養(yǎng)兩到三天后，換液去除未貼壁的血細(xì)胞等，按照1∶2的接種比例經(jīng)胰酶消化后傳代至25 cm2培養(yǎng)瓶中，采用含體積

4、分?jǐn)?shù)10％胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)1％青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基每2-3天換液1次，大約7天左右細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底后可傳三代，胰酶消化后按1∶2傳代，通過光鏡及倒置顯微鏡觀察SD大鼠BMSCs生長(zhǎng)及形態(tài)變化特點(diǎn)。取三代BMSCs不含EDTA胰酶消化，PBS沖洗細(xì)胞3次計(jì)數(shù)，采用流式鑒定法檢測(cè)表面標(biāo)記CD29、CD34、CD44、CD45表達(dá)情況。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組處理
　　將細(xì)胞分為四組，對(duì)照組（加入等量

5、PBS），NPY(10-8 mol/L)組，NPY(10-10mol/L)組，NPY（10-12 mol/L）組，將3代的BMSCs更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(10mMβ-甘油磷酸鈉，100 nM地塞米松，50μg/mL維生素C，10％ FBS，a-MEM)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，于培養(yǎng)7、14天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和茜素紅染色;培養(yǎng)7、14、21天采用q-PCR法檢測(cè)各組成骨標(biāo)志物ALP，Ⅰ型膠原

6、(collagen typeⅠ)，骨鈣素(osteocalcin)及Runx2的基因表達(dá)情況，Western blot法檢測(cè)ALP蛋白表達(dá)情況，以確定在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下NPY對(duì)BMSCs成骨分化調(diào)控效應(yīng)的濃度特異性。
　　3.堿性磷酸酶染色和茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞成骨染色
　　取第三代BMSCs，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，于成骨誘導(dǎo)第7天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ALP染色，PBS清洗三遍后在96孔板內(nèi)加入甲醇固定，隨后加入ALP染液，沖洗封片。于培養(yǎng)

7、14天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，PBS沖洗后經(jīng)24孔板內(nèi)加入95％酒精固定細(xì)胞，然后茜素紅染色5min;蒸餾水沖洗若干次，干燥，封片。最后放置顯微鏡下觀察成骨誘導(dǎo)效果并拍照。
　　4.q-PCR、Western blot檢測(cè)成骨基因和蛋白表達(dá)
　　提取實(shí)驗(yàn)組總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，熒光定量測(cè)定ALP, collagen typeⅠ，osteocalcin及Runx2含量。相關(guān)結(jié)果于7天、14天和21天分別測(cè)定三次。提取實(shí)驗(yàn)組A

8、LP蛋白后，定量測(cè)定ALP蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　在體外可通過全骨髓貼壁法成功分離培養(yǎng)出可用于實(shí)驗(yàn)的較高純度大鼠BMSCs。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示CD29（92.4％±1.6％），CD34(5.1％±1.3％)，CD44(86.7％±3.1％)，，CD45(9.2％±2.5％)，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型特征。不同濃度NPY作用于BMSCs可不同程度提高成骨標(biāo)志物以及ALP蛋白水平表達(dá)，其中以NPY(10-10mo

9、l/L)濃度調(diào)控成骨效應(yīng)最為強(qiáng)烈。
　　結(jié)論:
　　神經(jīng)肽Y可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
　　第2部分 神經(jīng)肽Y在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中對(duì)骨形成蛋白2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響
　　目的:
　　探討不同濃度NPY在BMSCs成骨分化中對(duì)BMP-2和VEGF表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組處理
　　將細(xì)胞分為四組，對(duì)照組（加入等量PBS），NPY（10-8

10、 mol/L）組，NPY(10-10mol/L)組，NPY(10-12 mol/L)組，將3代的BMSCs更換成骨誘導(dǎo)液（10mMβ-甘油磷酸鈉，100 nM地塞米松，50μg/mL維生素C，10％ FBS，a-MEM）進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，于培養(yǎng)7、14、21天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DAB免疫組化染色，采用q-PCR和Western blot法檢測(cè)BMP、VEGF基因和蛋白的表達(dá)情況。
　　2.免疫組織化學(xué)法測(cè)定BMP-2和VEGF表達(dá)

11、　　取三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后，甲醇固定液固定半小時(shí)后，使用體積分?jǐn)?shù)為0.1％TritonⅩ破膜10分鐘。封閉內(nèi)源性過氧化物酶。脫脂牛奶室溫封閉10min。加入VEGF、BMP2一抗孵育，4℃避光孵育過夜，二抗室溫下孵育30min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)對(duì)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行顯色。干燥，封片。最后放置顯微鏡下觀察成骨誘導(dǎo)效果并拍照。
　　3.q-PCR和Western blot法檢測(cè)BMP-2、VEGF基因和蛋白的表達(dá)
　　取三代細(xì)胞進(jìn)

12、行實(shí)驗(yàn)處理后，提取實(shí)驗(yàn)組總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，熒光定量測(cè)定BMP-2、VEGF含量。相關(guān)結(jié)果于7天、14天和21天分別測(cè)定三次。提取實(shí)驗(yàn)組BMP-2、VEGF蛋白后，定量測(cè)定BMP-2、VEGF蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在神經(jīng)肽NPY作用后的第7、14、21天，BMP-2和VEGF的DAB染色陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。q-PCR和Western blot結(jié)果示NPY作用于BMSCs后7、14、21天，可

13、提高BMP-2、VEGF基因和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中，神經(jīng)肽Y可以促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)BMP-2和VEGF，且效應(yīng)具有濃度特異性。
　　第3部分 神經(jīng)肽Y調(diào)控BMSCs生物學(xué)效應(yīng)及其相關(guān)Wnt通路的初步探討
　　目的:
　　初步探討NPY調(diào)控BMSCs生物學(xué)效應(yīng)及其與經(jīng)典Wnt通路相關(guān)性。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組處理
　　根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所確定的NPY濃度

14、，取三代BMSCs，將細(xì)胞分為四組，對(duì)照組(加入等量PBS)，NPY(10-10mol/L)組，NPY(10-10 mol/L)+NPYY1受體拮抗劑組PD160170(1μM)組以及NPY(10-10 mol/L)+Wnt通路拮抗劑DKK1（0.2μg/mL）組。q-PCR測(cè)定成骨標(biāo)志物ALP, collagen typeⅠ，osteocalcin、Runx2、BMP-2和VEGF基因以及Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因β-Catenin基因的

15、表達(dá)，Westernblot法檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-Catenin和P-GSK-3β蛋白的表達(dá)。
　　2.q-PCR、Western blot法檢測(cè)Wnt通路和成骨標(biāo)志物基因、蛋白表達(dá)
　　提取實(shí)驗(yàn)組總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，熒光定量測(cè)定ALP, collagen typeⅠ，osteocalcin、Runx2和β-Catenin含量。相關(guān)結(jié)果于培養(yǎng)7、14、21天分別測(cè)定三次。提取實(shí)驗(yàn)組β-Catenin和P-GS

16、K-3β蛋白后，定量測(cè)定β-Catenin和P-GSK-3β蛋白表達(dá)。
　　3.免疫細(xì)胞熒光法檢測(cè)β-catenin蛋白定位
　　取三代BMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后，甲醇固定液處理30分鐘后，使用體積分?jǐn)?shù)0.1％TritonⅩ破膜10分鐘，脫脂牛奶封閉抗體30分鐘，隨后用以1∶300稀釋的β-catenin一抗PBST溶液在4°避光條件下孵育過夜。PBS沖洗三次后，加入FITC綠色熒光二抗在室溫下避光孵育30分鐘，吸出液體后使用

17、DAPI染色15分鐘，放置熒光顯微鏡下觀察并拍照。
　　結(jié)果:
　　10-10mol/L濃度的NPY能明顯提高BMSCs細(xì)胞成骨標(biāo)志物、Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)能提高β-catenin蛋白和P-GSK-3β蛋白的表達(dá)，并可促進(jìn)β-catenin蛋白轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，NPYY1受體拮抗劑、Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK1能明顯抑制NPY的這些作用。
　　結(jié)論:
　　神經(jīng)肽Y調(diào)控骨髓間充質(zhì)