鐮孢紅素酮對腎臟細胞的毒性機制及輔酶Q10對其保護效應(yīng)的研究.pdf

1、鐮孢紅素酮(Fusarochromanone，F(xiàn)C101)，是由鐮刀茵屬木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)產(chǎn)生的一種真菌毒素，廣泛存在于動物飼料、糧食及農(nóng)作物中。畜禽持續(xù)攝入被FC101污染的食物及飼料后，可能會出現(xiàn)急性癥狀，也可能導(dǎo)致嚴(yán)重的慢性病變，最終引發(fā)癌癥，從而給畜禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。盡管有一些研究對FC101危害人類及動物健康的毒性機制進行探索，但是FC101毒素的毒性機理尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)FC101可能通過

2、阻滯細胞于G1期，抑制細胞增殖，引起腎臟細胞COS7，HEK293的毒性作用，并且可能通過caspase依賴和非依賴兩種方式引起腎臟細胞死亡。通過進一步探討FC101引起細胞死亡的分子機制，我們發(fā)現(xiàn)FC101可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，ROS發(fā)揮促進凋亡和自噬的作用。此外FC101誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生細胞毒性可能涉及到了ROS介導(dǎo)的FC101下調(diào)PP2A，PP5蛋白表達水平，從而導(dǎo)致JNK通路激活。輔酶Q10(CoQ10)是呼吸鏈的重要成員之一，它與

3、線粒體內(nèi)膜相結(jié)合，參與細胞氧化磷酸化及ATP生成過程，是細胞自身的天然抗氧化劑，細胞代謝的激活劑。目前臨床上CoQ10主要應(yīng)用于急、慢性充血性心力衰竭，病毒性肝炎和癌癥的輔助治療。CoQ10在ROS造成的損傷下可保護并增強細胞功能。但是關(guān)于CoQ10在FC101誘導(dǎo)腎臟細胞死亡中的作用尚未見報道。本實驗將探究FC101對腎臟細胞的毒性機制及CoQ10對其的保護效應(yīng)。試驗分為以下四個部分:
　　1.FC101對腎臟細胞周期分布的影響

4、及其機制探討FC101對腎臟細胞COS7，HEK293的毒性效應(yīng)。以COS7，HEK293細胞為細胞模型，F(xiàn)C101(0～5μM)單獨處理細胞6天或者24～72h，在倒置相差顯微鏡下分析細胞形態(tài)，one-solution實驗測定細胞存活率，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，Western Blot實驗分析細胞周期蛋白變化。我們發(fā)現(xiàn)，細胞經(jīng)不同濃度的FC101(0～5μM)處理6天后，細胞細胞密度及個數(shù)明顯減少，細胞增殖減慢，細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，表

5、現(xiàn)為貼壁細胞變圓、皺縮、脫落、細胞體積變小。FC101以濃度依賴方式抑制腎臟細胞COS7，HEK293增殖，誘導(dǎo)細胞死亡。此外，當(dāng)細胞暴露于FC101時間為24～72小時后，one-solution檢測法結(jié)果顯示FC101降低細胞活性。流式細胞術(shù)檢測顯示，細胞經(jīng)FC101處理24小時后，細胞停滯在G0/G1期的比例從33.2％上升到57.4％，F(xiàn)C101呈劑量依賴性阻滯細胞周期于G0/G1期。此外，用1μM濃度的FC101分別處理細胞2

6、4小時，48小時，72小時后，F(xiàn)C101呈時間依賴性阻滯細胞于G0/G1期。同時，F(xiàn)C101呈劑量依賴性和時間依賴性下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1，細胞周期依賴性激酶(CDK4和CDK6)，細胞周期調(diào)控因子Cdc25A的表達，同時上調(diào)細胞周期素依賴性激酶抑制因子(p21 Cip1，p27Kip1)的表達，進而導(dǎo)致Rb去磷酸化。結(jié)果表明，F(xiàn)C101通過下調(diào)細胞周期調(diào)控因子CyclinD1、CDK4、CDK6、Cdc25A、p-Rb，

7、上調(diào)細胞周期素依賴性激酶抑制因子p21Cip1，p27 Kip1的表達進而阻滯細胞于G0/G1期，從而抑制細胞增殖，引起細胞毒性作用。
　　2.FC101對腎臟細胞凋亡和自噬的影響探究FC101如何誘導(dǎo)細胞死亡以及FC101誘導(dǎo)細胞死亡的分子機制。以COS7，HEK293細胞為細胞模型，F(xiàn)C101(0～5μM)單獨處理細胞或者使用泛caspase抑制劑(Z-VAD-FMK)、自噬抑制劑(CQ)、ROS清除劑(NAC)預(yù)處理細胞后聯(lián)

8、用FC101(0～5μM)處理0～72小時;采用腺病毒Ad-GFP-LC3感染COS7細胞24小時后，再用FC101處理24小時。Trypan blue拒染法檢測細胞死亡率、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)和DAPI染色檢測細胞凋亡、免疫熒光染色法檢測自噬、CM-H2DCFDA檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成、Caspase-3/7 Assay試劑盒檢測Caspase-3/7活性，Western Blot分析BAD、BAX

9、、BAK、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、survivin、DR5、cleaved caspase3、cleaved caspase8、cleaved PARP、AIF、LC3A/B、H2A、γ-H2AX(ser139)、p53、ATM、phospho-ATM(ser1981)、ATR、phospho-ATR(ser428)、NFκB(p65)，phospho-NFκB(p65)(Ser139)蛋白表達及活性表現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C1

10、01呈劑量依賴和時間依賴方式引起細胞死亡。同時FC101呈濃度依賴方式上調(diào)促凋亡蛋白BAD及外部死亡受體通路蛋白DR5的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、survivin表達，提高cleaved caspase8蛋白表達量及活化caspase3，并以濃度依賴方式造成PARP裂解。但是并未顯著引起促凋亡基因BAK和BAX的表達變化。此外，細胞經(jīng)FC101處理后，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察下發(fā)現(xiàn)，細胞核經(jīng)DAPI染色后

11、出現(xiàn)核皺縮，核碎裂，染色質(zhì)聚集等凋亡特征，我們還發(fā)現(xiàn)FC101誘導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)因子AIF發(fā)生核移位，AIF由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核。并且FC101誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬，表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ顆粒聚集程度增加，LC3Ⅱ蛋白表達量提高，使用自噬抑制劑氯喹(CQ)處理細胞后，通過one-solution實驗分析可知自噬抑制劑CQ顯著提高細胞存活率，減輕FC101對細胞的毒性作用。另外，使用特異性熒光探針CM-H2DCFDA檢測細胞內(nèi)ROS的生成發(fā)現(xiàn)FC

12、101引起細胞內(nèi)ROS水平呈濃度依賴性和時間依賴性升高。激光共聚焦熒光觀測結(jié)果顯示ROS清除劑NAC可使細胞核碎裂減少，保持胞核完整性，減少凋亡細胞數(shù)量。NAC顯著降低胞質(zhì)內(nèi)LC3Ⅱ顆粒聚集程度。同樣NAC降低促凋亡蛋白BAD，cleavedcaspase3的蛋白表達量，增加抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達量。此外，F(xiàn)C101以濃度依賴方式激活NFκB、P53，并且引起DNA損傷蛋白H2AX和ATM磷酸化表達水平升高。結(jié)果表明，F(xiàn)C101誘

13、導(dǎo)COS7、HEK293細胞發(fā)生凋亡及自噬，引起細胞死亡，機制上可能涉及NFκB和p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。并且FC101誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，ROS發(fā)揮促進凋亡和自噬的作用。此外FC101可能造成DNA損傷。
　　3.氧化應(yīng)激和JNK信號通路介導(dǎo)的FC101誘導(dǎo)腎臟細胞毒性機制研究探討FC101致腎臟細胞COS7，HEK293死亡的毒性機制及涉及到的相關(guān)信號通路。COS7和HEK293細胞為細胞模型，F(xiàn)C101(0～5μM)單獨處理或使用ROS

14、清除劑(NAC)，JNK抑制劑SP600125預(yù)處理細胞1小時后聯(lián)用FC101(0～5μM)處理24小時;采用腺病毒干擾，過表達c-Jun、PP2A、PP5后，經(jīng)FC101(0.5，1μM)處理24小時。CM-H2DCFDA檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)生成，倒置相差顯微鏡下分析細胞形態(tài)，one-solution實驗測定細胞存活率，Western Blot分析MAPK信號通路中MAPK(Erk1/2、JNK、p38)和蛋白磷酸酶(PP2A，

15、PP5)的表達水平。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C101誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，激活JNK信號通路，使用JNK抑制劑(SP600125)或者使用腺病毒過表達c-Jun后可削弱FC101對細胞的毒性。N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)預(yù)處理后可明顯清除FC101誘導(dǎo)下的ROS產(chǎn)生。此外，ROS抑制JNK通路激活，減輕細胞毒性。FC101引起ROS水平升高，降低絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶5(PP5)的表達量，NAC則阻止FC10

16、1下調(diào)蛋白磷酸酶PP2A,PP5的表達量。此外，過表達PP2A，PP5可抑制JNK磷酸化以及減輕細胞毒性。結(jié)果表明，F(xiàn)C101通過誘導(dǎo)ROS，下調(diào)蛋白磷酸酶PP2A，PP5的表達，進而激活JNK通路引起腎臟細胞毒性作用。
　　4.C0Q10通過抑制氧化應(yīng)激及JNK通路保護FC101誘導(dǎo)COS7細胞毒性探討CoQ10對于FC101損傷細胞后的保護作用及其保護機制。本實驗以COS7細胞作為細胞模型，使用FC101(0～5μM)單獨處理

17、或者使用CoQ10，或JNK抑制劑SP600125預(yù)處理細胞1小時或30分鐘后，聯(lián)用FC101(0～5μM)處理6天或24小時;采用腺病毒干擾，過表達c-Jun后，細胞經(jīng)CoQ10預(yù)處理1小時，再用FC101(1μM)處理24小時。CM-H2DCFDA檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成，倒置相差顯微鏡下分析細胞形態(tài)，one-solution實驗測定細胞活性，Western Blot分析c-Jun、Bad、Bcl-xL和cleaved-ca

18、spase3的表達水平。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C101通過誘導(dǎo)ROS引起細胞凋亡，CoQ10可通過阻止ROS產(chǎn)生，進而抑制細胞凋亡。CoQ10可顯著削弱FC101誘導(dǎo)下的細胞活性降低，并且CoQ10恢復(fù)細胞形態(tài)學(xué)，抑制細胞核皺縮及碎裂。CoQ10可減少Bad的表達水平、提高Bcl-xL的的表達水平、降低caspase-3的活性。此外，CoQ10抑制JNK通路激活。使用JNK抑制劑(SP600125)或腺病毒過表達c-Jun則增強CoQ10削弱FC