五谷蟲(chóng)促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來(lái),隨著抗生素濫用情況的日益嚴(yán)重,由耐藥菌引起的嚴(yán)重感染性創(chuàng)面逐漸增多,臨床缺乏有效的治療手段。由于此類(lèi)創(chuàng)面愈合的病程長(zhǎng)、并發(fā)癥多,嚴(yán)重影響了患者的健康和生活質(zhì)量,給社會(huì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。中國(guó)傳統(tǒng)中藥“五谷蟲(chóng)”,為麗蠅科絲光綠蠅、大頭金蠅的幼蟲(chóng)?！侗静菥V目》、《本草求原》均記載:該蟲(chóng)性寒無(wú)毒,可搽敷外用,能治療臁瘡等外科疾病。五谷蟲(chóng)療法,是近年來(lái)興起的有效治療耐藥菌引起的嚴(yán)重感染創(chuàng)面的新型生物治療方法,即臨床上應(yīng)用活體無(wú)菌麗蠅科絲光綠蠅

2、幼蟲(chóng),來(lái)治療耐藥菌感染創(chuàng)面,已取得滿(mǎn)意效果,其作用機(jī)制主要包括:生物清創(chuàng)、抗菌和促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
　　 本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí),五谷蟲(chóng)對(duì)感染創(chuàng)面起到抗菌作用的有效成分為具有生物活性的抗菌肽類(lèi)蛋白。但是目前對(duì)五谷蟲(chóng)促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用有效成分的功能學(xué)研究尚無(wú)報(bào)道,仍存在以下尚未解決的問(wèn)題:
　　 (1)目前國(guó)際上應(yīng)用活體五谷蟲(chóng)生物清創(chuàng)的同時(shí),利用活體五谷蟲(chóng)分泌的活性成分,控制創(chuàng)面的細(xì)菌感染;而我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)記載五谷蟲(chóng)作為一種中藥

3、,經(jīng)過(guò)炮制后,使用其干粉外敷,同樣可以促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。但是尚缺乏活體五谷蟲(chóng)有效成分和五谷蟲(chóng)干粉的比較研究;(2)皮膚創(chuàng)面愈合病理過(guò)程復(fù)雜,涉及修復(fù)細(xì)胞的遷移、創(chuàng)面血管生成和局部神經(jīng)再生等多個(gè)過(guò)程。關(guān)于五谷蟲(chóng)有效成分對(duì)上述愈合過(guò)程的影響機(jī)制尚不清楚;(3)五谷蟲(chóng)在中藥學(xué)作為一種動(dòng)物中藥,其成分復(fù)雜,大多為大分子化合物,分離分析難度較大,這大大的限制了五谷蟲(chóng)干粉在臨床上的應(yīng)用,遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于臨床上對(duì)活體五谷蟲(chóng)的應(yīng)用。因此,對(duì)待動(dòng)物藥,必須在理論

4、和方法上有所創(chuàng)新,研究和開(kāi)發(fā)其有效成分。
　　 為了解決以上幾個(gè)問(wèn)題,本課題從多種五谷蟲(chóng)有效成分獲取方式出發(fā),采用組織形態(tài)學(xué)、藥物化學(xué)、藥物分析及分子生物學(xué)方法,比較了五谷蟲(chóng)有效成分不同獲取方式對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程的影響,并對(duì)其有效組分進(jìn)行提取、分析,尋找五谷蟲(chóng)對(duì)創(chuàng)面愈合有促進(jìn)作用的有效成分,并明確其作用機(jī)制以及可能參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 本課題研究分三個(gè)部分:(1)五谷蟲(chóng)成分不同獲取方式對(duì)創(chuàng)面愈合作用的比較研究;(2)活

5、體五谷蟲(chóng)成分對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用及其機(jī)制研究;(3)中藥五谷蟲(chóng)脂肪酸組分對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用及其機(jī)制研究。
　　 1.五谷蟲(chóng)成分不同獲取方式對(duì)創(chuàng)面愈合作用的比較研究
　　 本部分選用了活體五谷蟲(chóng)的勻漿產(chǎn)物和中藥五谷蟲(chóng)干粉為研究對(duì)象,對(duì)比兩種使用方法對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)面愈合過(guò)程的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):創(chuàng)傷后第1和第3天五谷蟲(chóng)勻漿物組、五谷蟲(chóng)干粉組和對(duì)照組創(chuàng)面愈合率無(wú)顯著性差異(P＞0.05);創(chuàng)傷后第7,10和14天五谷蟲(chóng)勻漿物組和五

6、谷蟲(chóng)干粉組的創(chuàng)面愈合率高于對(duì)照組(P＜0.05),五谷蟲(chóng)勻漿物組和五谷蟲(chóng)干粉組創(chuàng)面愈合率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。組織學(xué)觀(guān)察顯示:在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中,勻漿物組、干粉組與對(duì)照組相比,肉芽組織成熟,血管垂直于創(chuàng)面生長(zhǎng),膠原纖維排列整齊,瘢痕窄,成縱行條帶,可見(jiàn)再生的皮膚附屬器,再生上皮厚,爬行距離遠(yuǎn)。因此,活體五谷蟲(chóng)勻漿物和中藥五谷蟲(chóng)干粉都可以減少大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合時(shí)間、提高創(chuàng)面的愈合率和愈合質(zhì)量。
　　 2.活體五谷蟲(chóng)成分對(duì)創(chuàng)面

7、愈合的促進(jìn)作用及其機(jī)制研究
　　 (1)五谷蟲(chóng)分泌物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制研究
　　 本實(shí)驗(yàn)部分以活體五谷蟲(chóng)的分泌物(ES)為研究對(duì)象,應(yīng)用體外創(chuàng)面愈合模型,研究分泌物對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HMEC-1)遷移和增殖的影響,以及參與的信號(hào)通路。MTT法檢測(cè)ES對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示:雖然在10μg/ml ES下,內(nèi)皮細(xì)胞活力最大,但不同濃度ES對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(P＞0.05);進(jìn)一步應(yīng)用體外創(chuàng)面愈

8、合模型和Transwell法,結(jié)果顯示:10μg/ml ES可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移;應(yīng)用Western-blot技術(shù)結(jié)果表明,ES可以誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞發(fā)生遷移,并且時(shí)間依賴(lài)性激活A(yù)KT1,而不是ERK1/2。另外,應(yīng)用P13K抑制劑LY294002,可以部分降低ES誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移,完全地抑制ES誘導(dǎo)的AKT1激活。因此,ES對(duì)人微血管內(nèi)HMEC-1的遷移具有促進(jìn)作用,而對(duì)增殖無(wú)影響;ES誘導(dǎo)HMEC-1的遷移作用,主要是激活PI3K/A

9、KT1通路,而非ERK1/2 MAPK通路。
　　 (2)五谷蟲(chóng)勻漿物對(duì)創(chuàng)面神經(jīng)再生的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)部分以活體五谷蟲(chóng)的勻漿物作為研究對(duì)象,研究五谷蟲(chóng)的勻漿物對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)面P物質(zhì)(SP)分泌和蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)表達(dá)的影響,進(jìn)而探討五谷蟲(chóng)勻漿物促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制及它對(duì)創(chuàng)面神經(jīng)再生的影響。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:創(chuàng)傷后第3,7和10天,五谷蟲(chóng)勻漿物組SP表達(dá)的面積、平均光密度和積分光密度均高于對(duì)照組(P＜0.

10、05);創(chuàng)傷后第7和10天,PGP9.5表達(dá)在再生神經(jīng)中,五谷蟲(chóng)勻漿物組表達(dá)多于對(duì)照組(P＜0.05),創(chuàng)傷后第14天,五谷蟲(chóng)勻漿物組內(nèi)真皮淺層仍見(jiàn)PGP9.5表達(dá)在再生神經(jīng)中,而對(duì)照組未見(jiàn)表達(dá)。因此,活體五谷蟲(chóng)勻漿物可以促進(jìn)創(chuàng)面SP和PGP9.5的表達(dá),并且可能通過(guò)促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)面神經(jīng)再生,進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
　　 3.中藥五谷蟲(chóng)脂肪酸組分對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用及其機(jī)制研究
　　 本部分應(yīng)用藥物化學(xué)提純方法,提取五谷蟲(chóng)干

11、粉中的脂肪酸成分,應(yīng)用大鼠創(chuàng)面愈合模型,明確該脂肪酸提取物與創(chuàng)面愈合和血管生成之間的關(guān)系,尋找五谷蟲(chóng)的有效成分組。結(jié)果顯示:創(chuàng)傷后第7天和第10天,五谷蟲(chóng)提取物可提高創(chuàng)面愈合率(P＜0.05);免疫組織化學(xué)顯示:創(chuàng)傷后第3天,五谷蟲(chóng)提取物可促進(jìn)創(chuàng)面微血管密度(MVD)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)的表達(dá)(P＜0.05);RT-PCR和Western-blot顯示:創(chuàng)傷后第3天,五谷蟲(chóng)提取物可促進(jìn)VEGFA基因和蛋白的表達(dá)(P＜0.0