五谷蟲新鮮提取物對(duì)體內(nèi)和體外皮膚損傷修復(fù)的促進(jìn)作用及其分子機(jī)制的分析.pdf

1、目的:
　　各種損傷因素所導(dǎo)致的急慢性皮膚創(chuàng)傷是臨床最常見的疾患之一。創(chuàng)傷治療的目的是清創(chuàng)后采用有效手段促進(jìn)創(chuàng)面盡快愈合，恢復(fù)受損組織的功能。已知，創(chuàng)面愈合是皮膚受損組織通過(guò)十分復(fù)雜但又有序的自我修復(fù)機(jī)制使整個(gè)創(chuàng)面恢復(fù)原貌的過(guò)程。研究表明，皮膚損傷修復(fù)過(guò)程不但存在皮膚內(nèi)各細(xì)胞組分的增殖還有賴于一系列緊密聯(lián)系的生化和分子生物學(xué)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些分子機(jī)制逐一和遞次地出現(xiàn)在皮膚損傷修復(fù)的四個(gè)階段，即止血，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞增殖和塑形，最終實(shí)現(xiàn)

2、皮膚創(chuàng)面如期修復(fù)愈合;換言之，正是損傷修復(fù)相關(guān)因子推動(dòng)了損傷修復(fù)的進(jìn)程。因此，深入認(rèn)識(shí)損傷修復(fù)的分子機(jī)制，進(jìn)而采取有效的治療手段調(diào)節(jié)修復(fù)促進(jìn)因子的表達(dá)和產(chǎn)生具有重要的理論價(jià)值和臨床意義。同時(shí)，對(duì)損傷修復(fù)促進(jìn)因子（因素）的上調(diào)作用正在成為評(píng)價(jià)創(chuàng)傷治療效果的重要指標(biāo)。
　　長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐證實(shí)，將醫(yī)用絲光綠蠅蛆蟲（簡(jiǎn)稱五谷蟲）放置于創(chuàng)面表面可以對(duì)創(chuàng)面起到祛腐清創(chuàng)的作用。這一治療方法尤其適用于感染及壞死較為嚴(yán)重的慢性創(chuàng)面和潰瘍的治療。盡管

3、五谷蟲具有吞噬和去除污染及感染組織的作用，但由于主客觀的原因并非所有患者都能夠接受這種治療方法;另外，蛆蟲短暫的成熟期使它們很快變蛹失去效用。近期研究發(fā)現(xiàn)，五谷蟲促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用不僅是通過(guò)吞噬感染組織，其分泌和排泄物中也含有一些有益于抗菌和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，五谷蟲蟲體本身具有很強(qiáng)的自我修復(fù)能力，從而進(jìn)一步說(shuō)明五谷蟲蟲體細(xì)胞中含有促損傷修復(fù)的細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子，借助有效生物技術(shù)提取的蟲體蛋白有可能是治療皮膚創(chuàng)傷尤其是

4、慢性損傷和不愈合創(chuàng)面的潛在生物制劑。不過(guò)，目前有關(guān)這方面的研究還鮮見報(bào)道。
　　如前所述，損傷修復(fù)有賴于皮膚組織中各細(xì)胞組分的分裂、增殖、游走和新生血管形成，而這些細(xì)胞分子生物學(xué)現(xiàn)象受到某些生長(zhǎng)因子的調(diào)控。這些生長(zhǎng)因子以協(xié)調(diào)和互補(bǔ)的方式共同促進(jìn)損傷愈合的進(jìn)程，它們包括表皮生長(zhǎng)因子/EGF,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子/TGF家族蛋白，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子/FGF,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/HGF和血小板衍生生長(zhǎng)因子/PDGF等。進(jìn)一步的研究表明，這些因子作為

5、分子信號(hào)主要通過(guò)特定的或由其它蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)調(diào)節(jié)諸如c-Myc，Bcl-2，survivin，cyclinD1和VEGF等基因的表達(dá)發(fā)揮其損傷修復(fù)促進(jìn)作用。大量研究證實(shí)，Wnt, STAT3，TGF-beta-Smad2/3，NF-κB和Notch等信號(hào)通路參與了損傷修復(fù)和組織再生的過(guò)程。盡管五谷蟲及其提取物的促損傷修復(fù)的效果得到證實(shí)，但其作用的分子機(jī)制尤其是對(duì)上述生長(zhǎng)因子，信號(hào)通路以及通路下游基因表達(dá)的影

6、響迄今尚無(wú)報(bào)道。闡明上述問(wèn)題將為五谷蟲制劑的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)，因此成為本課題的研究目的。
　　五谷蟲本身，其分泌/排泄物以及蟲體提取物都有一定的損傷修復(fù)促進(jìn)作用，但目前還不清楚哪些組分發(fā)揮更大的作用。因此，在相同的動(dòng)物體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)條件下觀察這些組分的促進(jìn)損傷修復(fù)的功效以及它們對(duì)損傷修復(fù)相關(guān)因子/信號(hào)通路的影響能夠科學(xué)地回答這個(gè)問(wèn)題，也有助于五谷蟲提取物的合理使用與配制。這也成為本博士論文的另一個(gè)立題依據(jù)。
　　方法:

7、
　　一.五谷蟲樣品制備:蛆蟲分泌/排泄物:蛆蟲經(jīng)常規(guī)處理后收集。20克冰凍蛆體，切成薄片，總蛋白提取，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共設(shè)4組（8只/組）:組1:凡士林軟膏涂抹;組2:分泌/排泄物(Secretion/excretion; S/E);組3:吐后蛆體裂解液(Extract+S/E);組4:未吐蛆體裂解液處理(Extract-S/E)。二.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:1.動(dòng)物選擇與飼養(yǎng)條件:取健康成年雄性SD大鼠32只，隨機(jī)分成4組（8只/組）。飼養(yǎng)于2

8、5℃，相對(duì)濕度為40％～70％環(huán)境下，每天接受自然光照9小時(shí)，由飲食飲水。2.損傷模型的建立:麻醉藥腹內(nèi)注射麻醉后，去毛劑脫毛:無(wú)菌下在背部造成2個(gè)直徑為1.5cm的圓形全層皮膚開放創(chuàng)面。造模動(dòng)物不用抗生素及抗凝劑。3.愈合情況觀察:于造模后第1、3、5、7、9、12、14和16天觀察創(chuàng)面的色澤、腫脹程度、表面滲液、肉芽組織生長(zhǎng)和表皮增生修復(fù)情況。用透明膜創(chuàng)面記錄表描畫創(chuàng)面外緣。
　　結(jié)果:
　　第一部分 三種五谷蟲提取物的

9、制備及產(chǎn)出量和質(zhì)量分析
　　1.五谷蟲提取物的制備量和濃度:使用280nm的紫外分光光度計(jì)測(cè)出OD值，計(jì)算出不含五谷蟲分泌物/排泄物的五谷蟲蟲體組（20克），含分泌物/排泄物的五谷蟲蟲體組（20克）和由20克五谷蟲分泌和排泄的混合物中的蛋白濃度，它們的含量分別是89.85mg(5.99μg/μl;5990μg/ml),88.05 mg(5.87μg/μl;5870μg/ml)和9 mg(0.6μg/μl;600μg/ml)。

10、>　　2.五谷蟲提取物組成成分分析:10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示:兩組蟲體提取物所含蛋白的分子量大小范圍從7 kDa到210 kDa，蛋白譜型基本一致，蛋白的條帶清晰，無(wú)拖尾降解現(xiàn)象但分泌/排泄后蟲體提取物的蛋白條帶略弱一些;分泌物/排泄物混合物未見大分子蛋白，條帶的分子量小于7 kDa。
　　3.采用新方法制備五谷蟲提取物縮短了制備時(shí)間:采用本文介紹的方法可在不到5分鐘即可完成五谷蟲粗提物的制各且操作過(guò)程十分簡(jiǎn)捷。

11、r>　　4.高濃度五谷蟲分泌的收集:采用本文收集方法可獲得濃度為600μg/ml甚至更高的混合物，使不經(jīng)濃縮甚至需稀釋后用于體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)成為可能。
　　第二部分 改良的透明膜測(cè)量法在計(jì)算大鼠皮膚損傷愈合率中的應(yīng)用
　　1.高通量的信息采集:按觀測(cè)不同的時(shí)間，組別和大鼠編號(hào)將所測(cè)創(chuàng)面簡(jiǎn)潔、整齊和有序的（一個(gè)創(chuàng)面的不同觀察日標(biāo)記信息“圈套圈”的形式）集成到本課題設(shè)計(jì)的一張長(zhǎng)方形透明膜上。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诘囊恍?shí)驗(yàn)組的創(chuàng)面提前愈合，

12、所以在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中總共在一張透明膜上記錄和收集了243個(gè)而非256個(gè)創(chuàng)面邊緣描記圖像。而傳統(tǒng)的透明膜測(cè)量方法是按預(yù)計(jì)觀測(cè)次數(shù)與創(chuàng)面數(shù)量準(zhǔn)備足夠數(shù)量的整張面積大于造模面積的正方形透明膜，并在每張透明膜上標(biāo)明觀測(cè)時(shí)間，組別和大鼠序號(hào)。因此，信息采集過(guò)程十分繁瑣、費(fèi)時(shí)和凌亂。
　　2.透明膜標(biāo)記信息的精確和高效處理:將含有243個(gè)創(chuàng)面邊緣描記圖像的透明膜經(jīng)掃描儀掃描入電腦并保存后，利用Adobe Photoshop CS4 site圖

13、像分析軟件工具欄中磁性套圈選項(xiàng)描記創(chuàng)面邊緣，點(diǎn)擊直方圖項(xiàng)（圖2C）查看創(chuàng)面像素值，并將像素值填在excel表中，對(duì)每個(gè)標(biāo)記信息的測(cè)量平均用時(shí)在27秒以內(nèi)。因此，在2小時(shí)之內(nèi)便可獲得所有觀測(cè)日包（括首日）全部243個(gè)創(chuàng)面的像素值和面積。
　　結(jié)論:
　　1.采用本課題組獨(dú)特的蛋白提取和分泌/排泄物收集方法，高產(chǎn)出，高質(zhì)量地制備出三種五谷蟲提取物，為下一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了可靠的保證。
　　2.建立和完善了透明膜創(chuàng)面面積標(biāo)記

14、和測(cè)量法并在精確計(jì)算大鼠皮膚損傷愈合率中應(yīng)用，獲得了可靠的數(shù)據(jù)，取得了更為精確的測(cè)量結(jié)果。
　　3.基于透明膜創(chuàng)面面積標(biāo)記和測(cè)量法的檢測(cè)結(jié)果顯示，含有分泌/排泄的，分泌/排泄后的五谷蟲蟲體提取物以及分泌/排泄混合物對(duì)大鼠皮膚損傷均有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用且前者的作用更為明顯。這提示，在五谷蟲蟲體及其分泌/排泄混合物中都含有損傷修復(fù)促進(jìn)因子。因此，在實(shí)踐中使用未經(jīng)分泌/排泄的蟲體提取物可能取得更好的治療效果。
　　4.中低濃度的五

15、谷蟲提取物對(duì)人角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，但濃度較高時(shí)則抑制細(xì)胞生長(zhǎng)甚至具有殺傷性。這種現(xiàn)象表明，五谷蟲提取物具有較強(qiáng)生物活性，因此在使用前應(yīng)該掌握其最佳使用濃度，以避免可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)。
　　5.對(duì)僅用凡士林處理和五谷蟲提取物處理創(chuàng)面的檢測(cè)結(jié)果顯示，提取物處理對(duì)創(chuàng)面組織內(nèi)NF-κB，Wnt2/β-catenin和Notch通路的狀態(tài)無(wú)明顯影響，說(shuō)明這三個(gè)通路未必是提取物作用的對(duì)象;換言之，后者對(duì)修復(fù)的促進(jìn)作用不是借助

16、這三個(gè)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　6.TGF-β/Smad3通路是公認(rèn)的損傷修復(fù)促進(jìn)因素而STAT3通路的活化能夠上調(diào)一系列細(xì)胞增殖促進(jìn)基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，五谷蟲提取物處理后的大鼠皮膚組織和人角質(zhì)及成纖維細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)這兩個(gè)通路的活化程度明顯提高，從而提示上述兩個(gè)通路的活化在五谷蟲提取物促進(jìn)損傷修復(fù)過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用。
　　7.RNA和蛋白質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果顯示，五谷蟲提取物處理的組織和細(xì)胞中這三個(gè)基因的表達(dá)明顯上調(diào)。由于NF-κ

17、B，Wnt2/β-catenin，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在被檢組織和細(xì)胞內(nèi)活化程度較低或處于不活化的狀態(tài)，而TGF-β/Smad3通路在一定程度上對(duì)c-Myc表達(dá)有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，故認(rèn)為c-Myc，cyclin D1 and VEGF表達(dá)上調(diào)很可能是STAT3通路活化的結(jié)果。TGF-β/Smad3和STAT3對(duì)c-Myc表達(dá)的雙向調(diào)節(jié)則提示，兩者在多階段損傷修復(fù)過(guò)程中可能存在某種互動(dòng)和功能交替，在生物功效上也許處于動(dòng)態(tài)平衡。這一點(diǎn)有待下一

18、步研究證明。
　　創(chuàng)新性:
　　本課題首次采用嶄新的創(chuàng)面信息采集和創(chuàng)面面積測(cè)算技術(shù)評(píng)估并證實(shí)三種五谷蟲提取物對(duì)大鼠皮膚損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。首次以主要的損傷修復(fù)相關(guān)信號(hào)通路及其下游靶基因作為切入點(diǎn)，以大鼠皮膚創(chuàng)面作為體內(nèi)模型，人角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，系統(tǒng)地分析了五谷蟲提取物促進(jìn)損傷修復(fù)的分子機(jī)制并得出較為肯定的結(jié)論。本課題獲得的研究結(jié)果為五谷蟲提取物的高質(zhì)量制備，科學(xué)合理的使用和療效評(píng)價(jià)提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)