容積調控氯通道的激活與細胞內Ca2+關系的研究.pdf

1、容積調控氯通道（VRCC）是氯離子通道大家族中的一員，它表達分布廣泛，在細胞維持一定容積與穩(wěn)態(tài)的調控過程中起到了關鍵作用，并與細胞凋亡等許多生理、病理過程密切相關。關于VRCC的分子基礎和激活機制多年來一直未有定論，近年來比較公認的說法是LRRC8（leucine-rich repeat-containing8）是VRCC的分子基礎，此外，也有證據(jù)表明構成Ca2+激活氯通道（CaCCs）的分子基礎 TMEM16（Anoctamins）及

2、bestrophin也可能參與VRCC的構成。
　　Ca2+是細胞內重要的第二信使，參與調控許多細胞生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，細胞腫脹引起的體積變化往往伴隨有細胞內Ca2+的升高，越來越多的證據(jù)表明，細胞內Ca2+通過微域形式（nanodomain Ca2+）參與VRCC的激活應該是VRCC激活的重要機制之一。
　　本課題致力于VRCC的激活機制的研究，第一部分主要探討 VRCC相關分子LRRC8A和ANO1對VRCC的貢獻；第二

3、部分主要探討細胞內Ca2+在VRCC激活過程中的作用。
　　第一部分 LRRC8A及ANO1對VRCC的貢獻。
　　目的：比較HEK293細胞中LRRC8A和ANO1對VRCC的貢獻。
　　方法：
　　1.HEK293細胞中的VRCC由細胞內高滲溶液或細胞外低滲溶液激活，VRCC電流由全細胞膜片鉗技術記錄，鉗制電壓為-60 mV。
　　2.利用CRISPR/Cas9技術敲除LRRC8A和ANO1，比較觀察分

4、別缺失二者對VRCC電流的影響。
　　3.觀察過表達LRRC8A和ANO1后對VRCC的影響。
　　結果：
　　1.在HEK293細胞，容積調控氯通道（VRCC）可被細胞內高滲或細胞外低滲激活，兩種激活方式產(chǎn)生的VRCC平均電流密度分別為62.33±3.98 pA/pF（n=22），和59.11±6.20 pA/pF。
　　2.敲除LRRC8A后，與野生對照HEK細胞相比，VRCC平均電流密度由62.33±3.9

5、8 pA/pF降到3.10±0.68 pA/pF；敲除ANO1后，平均電流密度由62.33±3.98 pA/pF降到49.42±8.36 pA/pF。
　　3.在LRRC8A-KO細胞中轉染LRRC8A質粒，VRCC平均電流密度恢復至野生對照HEK細胞水平53.34±20.20 pA/pF；轉染ANO1質粒，VRCC平均電流密度有所增加，但仍然低于野生對照HEK細胞水平，由ANO1介導的VRCC電流的動力學特征表現(xiàn)與鈣激活氯通道（

6、CaCCs）相似。
　　結論：
　　1.在HEK細胞，細胞內高滲或細胞外低滲激活誘發(fā)的VRCC電流大小基本一致，動力學特征一致，都表現(xiàn)為外向整流與正電壓下失活的特征。
　　2.在HEK細胞，LRRC8A和 ANO1都參與 VRCC的構成，其中LRRC8A貢獻較大。
　　第二部分細胞內Ca2+參與容積調控氯通道激活的研究
　　目的：評價細胞內Ca2+與VRCC激活的關系，比較低滲、血清、ATP引起細胞內 Ca

7、2+升高的變化規(guī)律，以及三者誘發(fā)的VRCC特征；探索伴隨細胞腫脹升高的內Ca2+來源。
　　方法：
　　1.應用全細胞膜片鉗技術記錄牽制電壓在-60 mV下HEK293細胞的VRCC。觀察細胞內分別加入Ca2+螯合劑BAPTA和EGTA后對VRCC電流的影響。
　　2.觀察細胞外鈣對VRCC的影響。
　　3.觀察細胞外低滲、等滲情況下血清、ATP導致的細胞內Ca2+瞬變。
　　4.觀察在細胞內外等滲情況下血

8、清和ATP誘發(fā)的VRCC電流。
　　5.觀察Ryanodine受體阻斷劑dantrolene和激動劑caffeine對VRCC的影響。
　　6.觀察利用CRISPR/Cas9敲除磷脂酶PLCγ1和PLCβ4對VRCC電流的影響。
　　7.觀察細胞外低滲對細胞膜PIP2的影響。
　　8.觀察細胞膜脂伐調節(jié)劑M-βCD對細胞外低滲、等滲血清和ATP誘發(fā)的VRCC電流的影響。
　　結果：
　　1.快速螯合細

9、胞內 Ca2+抑制 VRCC產(chǎn)生。在高滲細胞內液中加入BAPTA和EGTA，前者使VRCC平均電流密度由76.11±4.10 pA/pF（n=12）降至15.72±3.63 pA/pF，而后者對VRCC無影響。在等滲內液中加入BAPTA，并用低滲外液激活VRCC，平均電流密度由56.36±10.94 pA/pF降至2.88±0.51 pA/pF。
　　2.細胞外Ca2+對VRCC激活無影響。無Ca2+條件下由細胞內高滲激活的VRC

10、C的平均電流密度為74.28±11.44 pA/pF（n=12），與有外Ca2+情況下的VRCC電流62.33±3.98 pA/pF相比無差別。
　　3.低滲細胞外液、等滲血清、ATP都能誘發(fā)細胞內Ca2+瞬變，但Ca2+瞬變變化規(guī)律不同；敲除LRRC8A不影響內Ca2+濃度；去除細胞外Ca2+對ATP引起的細胞內Ca2+瞬變影響較大。
　　4.在細胞內外等滲情況下血清能夠誘發(fā)一過性VRCC電流，平均電流密度為6.88±1.

11、58 pA/pF（n=12），而ATP不能誘發(fā)VRCC。
　　5.調節(jié)Ryanodine受體功能影響VRCC產(chǎn)生。孵育dantrolene后，VRCC電流密度從71.61±4.89 pA/pF降至25.51±1.97 pA/pF；給予caffeine灌流，記錄的11個細胞只有2個產(chǎn)生微弱電流，電流密度分別為4 pA/pF和25 pA/pF。
　　6.PLC可能沒有直接參與VRCC的激活。敲除PLCγ1和PLCβ4基因后HEK

12、細胞的VRCC平均電流密度分別為67.05±9.53 pA/pF(n=14)和71.61±8.81 pA/pF(n=9)，兩者與對照HEK細胞79.95±3.85 pA/pF（n=10）相比較均沒有差別。
　　7.細胞外低滲條件基本不能誘發(fā)細胞膜PIP2水解。
　　8.孵育M-βCD對細胞外低滲和等滲血清誘發(fā)的VRCC無明顯影響。
　　結論：
　　1.細胞腫脹伴隨細胞內鈣增加，細胞內鈣以微域的形式（nanodom

13、ain Ca2+）參與VRCC的激活。VRCC激活時細胞內鈣升高是細胞內鈣庫釋放所致，而與細胞外 Ca2+無關；PIP2及 PLC信號通路可能沒有直接參與VRCC激活，可能不是細胞微域Ca2+的來源。
　　2.與細胞外低滲相似，血清、ATP在等滲條件下都可以誘發(fā)細胞內Ca2+瞬變，但血清可以誘發(fā)一過性VRCC，而ATP不能誘發(fā)VRCC，說明單純的內 Ca2+升高不能直接激活 VRCC，此外說明體積變化不是 VRCC激活的必要條件。