容積調(diào)控氯通道的激活與細(xì)胞內(nèi)Ca2+關(guān)系的研究.pdf

1、容積調(diào)控氯通道（VRCC）是氯離子通道大家族中的一員，它表達(dá)分布廣泛，在細(xì)胞維持一定容積與穩(wěn)態(tài)的調(diào)控過程中起到了關(guān)鍵作用，并與細(xì)胞凋亡等許多生理、病理過程密切相關(guān)。關(guān)于VRCC的分子基礎(chǔ)和激活機(jī)制多年來一直未有定論，近年來比較公認(rèn)的說法是LRRC8（leucine-rich repeat-containing8）是VRCC的分子基礎(chǔ)，此外，也有證據(jù)表明構(gòu)成Ca2+激活氯通道（CaCCs）的分子基礎(chǔ) TMEM16（Anoctamins）及

2、bestrophin也可能參與VRCC的構(gòu)成。
　　Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與調(diào)控許多細(xì)胞生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞腫脹引起的體積變化往往伴隨有細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高，越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+通過微域形式（nanodomain Ca2+）參與VRCC的激活應(yīng)該是VRCC激活的重要機(jī)制之一。
　　本課題致力于VRCC的激活機(jī)制的研究，第一部分主要探討 VRCC相關(guān)分子LRRC8A和ANO1對(duì)VRCC的貢獻(xiàn)；第二

3、部分主要探討細(xì)胞內(nèi)Ca2+在VRCC激活過程中的作用。
　　第一部分 LRRC8A及ANO1對(duì)VRCC的貢獻(xiàn)。
　　目的：比較HEK293細(xì)胞中LRRC8A和ANO1對(duì)VRCC的貢獻(xiàn)。
　　方法：
　　1.HEK293細(xì)胞中的VRCC由細(xì)胞內(nèi)高滲溶液或細(xì)胞外低滲溶液激活，VRCC電流由全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄，鉗制電壓為-60 mV。
　　2.利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除LRRC8A和ANO1，比較觀察分

4、別缺失二者對(duì)VRCC電流的影響。
　　3.觀察過表達(dá)LRRC8A和ANO1后對(duì)VRCC的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在HEK293細(xì)胞，容積調(diào)控氯通道（VRCC）可被細(xì)胞內(nèi)高滲或細(xì)胞外低滲激活，兩種激活方式產(chǎn)生的VRCC平均電流密度分別為62.33±3.98 pA/pF（n=22），和59.11±6.20 pA/pF。
　　2.敲除LRRC8A后，與野生對(duì)照HEK細(xì)胞相比，VRCC平均電流密度由62.33±3.9

5、8 pA/pF降到3.10±0.68 pA/pF；敲除ANO1后，平均電流密度由62.33±3.98 pA/pF降到49.42±8.36 pA/pF。
　　3.在LRRC8A-KO細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LRRC8A質(zhì)粒，VRCC平均電流密度恢復(fù)至野生對(duì)照HEK細(xì)胞水平53.34±20.20 pA/pF；轉(zhuǎn)染ANO1質(zhì)粒，VRCC平均電流密度有所增加，但仍然低于野生對(duì)照HEK細(xì)胞水平，由ANO1介導(dǎo)的VRCC電流的動(dòng)力學(xué)特征表現(xiàn)與鈣激活氯通道（

6、CaCCs）相似。
　　結(jié)論：
　　1.在HEK細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)高滲或細(xì)胞外低滲激活誘發(fā)的VRCC電流大小基本一致，動(dòng)力學(xué)特征一致，都表現(xiàn)為外向整流與正電壓下失活的特征。
　　2.在HEK細(xì)胞，LRRC8A和 ANO1都參與 VRCC的構(gòu)成，其中LRRC8A貢獻(xiàn)較大。
　　第二部分細(xì)胞內(nèi)Ca2+參與容積調(diào)控氯通道激活的研究
　　目的：評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)Ca2+與VRCC激活的關(guān)系，比較低滲、血清、ATP引起細(xì)胞內(nèi) Ca

7、2+升高的變化規(guī)律，以及三者誘發(fā)的VRCC特征；探索伴隨細(xì)胞腫脹升高的內(nèi)Ca2+來源。
　　方法：
　　1.應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄牽制電壓在-60 mV下HEK293細(xì)胞的VRCC。觀察細(xì)胞內(nèi)分別加入Ca2+螯合劑BAPTA和EGTA后對(duì)VRCC電流的影響。
　　2.觀察細(xì)胞外鈣對(duì)VRCC的影響。
　　3.觀察細(xì)胞外低滲、等滲情況下血清、ATP導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變。
　　4.觀察在細(xì)胞內(nèi)外等滲情況下血

8、清和ATP誘發(fā)的VRCC電流。
　　5.觀察Ryanodine受體阻斷劑dantrolene和激動(dòng)劑caffeine對(duì)VRCC的影響。
　　6.觀察利用CRISPR/Cas9敲除磷脂酶PLCγ1和PLCβ4對(duì)VRCC電流的影響。
　　7.觀察細(xì)胞外低滲對(duì)細(xì)胞膜PIP2的影響。
　　8.觀察細(xì)胞膜脂伐調(diào)節(jié)劑M-βCD對(duì)細(xì)胞外低滲、等滲血清和ATP誘發(fā)的VRCC電流的影響。
　　結(jié)果：
　　1.快速螯合細(xì)

9、胞內(nèi) Ca2+抑制 VRCC產(chǎn)生。在高滲細(xì)胞內(nèi)液中加入BAPTA和EGTA，前者使VRCC平均電流密度由76.11±4.10 pA/pF（n=12）降至15.72±3.63 pA/pF，而后者對(duì)VRCC無影響。在等滲內(nèi)液中加入BAPTA，并用低滲外液激活VRCC，平均電流密度由56.36±10.94 pA/pF降至2.88±0.51 pA/pF。
　　2.細(xì)胞外Ca2+對(duì)VRCC激活無影響。無Ca2+條件下由細(xì)胞內(nèi)高滲激活的VRC

10、C的平均電流密度為74.28±11.44 pA/pF（n=12），與有外Ca2+情況下的VRCC電流62.33±3.98 pA/pF相比無差別。
　　3.低滲細(xì)胞外液、等滲血清、ATP都能誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變，但Ca2+瞬變變化規(guī)律不同；敲除LRRC8A不影響內(nèi)Ca2+濃度；去除細(xì)胞外Ca2+對(duì)ATP引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變影響較大。
　　4.在細(xì)胞內(nèi)外等滲情況下血清能夠誘發(fā)一過性VRCC電流，平均電流密度為6.88±1.

11、58 pA/pF（n=12），而ATP不能誘發(fā)VRCC。
　　5.調(diào)節(jié)Ryanodine受體功能影響VRCC產(chǎn)生。孵育dantrolene后，VRCC電流密度從71.61±4.89 pA/pF降至25.51±1.97 pA/pF；給予caffeine灌流，記錄的11個(gè)細(xì)胞只有2個(gè)產(chǎn)生微弱電流，電流密度分別為4 pA/pF和25 pA/pF。
　　6.PLC可能沒有直接參與VRCC的激活。敲除PLCγ1和PLCβ4基因后HEK

12、細(xì)胞的VRCC平均電流密度分別為67.05±9.53 pA/pF(n=14)和71.61±8.81 pA/pF(n=9)，兩者與對(duì)照HEK細(xì)胞79.95±3.85 pA/pF（n=10）相比較均沒有差別。
　　7.細(xì)胞外低滲條件基本不能誘發(fā)細(xì)胞膜PIP2水解。
　　8.孵育M-βCD對(duì)細(xì)胞外低滲和等滲血清誘發(fā)的VRCC無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1.細(xì)胞腫脹伴隨細(xì)胞內(nèi)鈣增加，細(xì)胞內(nèi)鈣以微域的形式（nanodom

13、ain Ca2+）參與VRCC的激活。VRCC激活時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣升高是細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放所致，而與細(xì)胞外 Ca2+無關(guān)；PIP2及 PLC信號(hào)通路可能沒有直接參與VRCC激活，可能不是細(xì)胞微域Ca2+的來源。
　　2.與細(xì)胞外低滲相似，血清、ATP在等滲條件下都可以誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變，但血清可以誘發(fā)一過性VRCC，而ATP不能誘發(fā)VRCC，說明單純的內(nèi) Ca2+升高不能直接激活 VRCC，此外說明體積變化不是 VRCC激活的必要條件。