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文檔簡介
1、【目的】通過四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)法分別檢測金葉敗毒顆粒藥物血清抗人巨細胞病毒(HCMV)感染吸附、穿入、復制三環(huán)節(jié)的活性,探討金葉敗毒顆??笻CMV感染的作用機制。
【方法】
1.細胞懸液法原代培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞(Human embryonic lung fibroblast,HEL)。
2.HCMV AD169毒株體外細胞培養(yǎng)法傳毒增殖,Reed-Muench法計算病毒半數(shù)細胞感染
2、量TCID50。
3.制備金葉敗毒顆粒藥物血清:①將正常成年雌性日本大耳白兔按體重隨機分為低、中、高劑量組和空白對照組四組,每組3只;低、中、高劑量組給藥量分別為1.5g/Kg、3g/Kg、6g/Kg,相當于成人每次每公斤體重用藥劑量的5倍、10倍、20倍,用溫雙蒸水50ml溶解藥物,空白對照組給予等體積的雙蒸水;②低、中、高劑量組灌服相應劑量金葉敗毒顆粒,空白對照組灌服等體積的雙蒸水,每天上、下午各一次,連續(xù)3天,第4天
3、上午給藥后1h、1.5h、2h、2.5h、3h于兔耳中央動脈采血,血靜置2h,3000rpm離心20min,取上層淡黃色透明樣血清,56℃水浴滅活30min,一次性濾器過濾除菌,-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?;③使用前將所需劑量的血清?80℃取出,37℃水浴解凍,用細胞維持液將藥物血清配置為5%、10%、20%、藥物血清-DMEM培養(yǎng)液。
4.金葉敗毒顆粒藥物血清細胞毒性檢測:將HEL細胞懸液以1×105/ml的密度接種于96
4、孔培養(yǎng)板,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時,用各組藥物血清-DMEM培養(yǎng)液干預細胞,細胞病變法(Cytopathogenic Effect,CPE)觀察細胞形態(tài)變化,MTT法檢測OD值,篩選出無細胞毒性的藥物血清-DMEN培養(yǎng)液。
5.金葉敗毒顆粒藥物血清抗病毒活性檢測:將HEL細胞懸液以1×105/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時,先后用100TCID50/100ul的HCMV
5、AD169株100ul、篩選出的無細胞毒性的藥物血清-DMEM培養(yǎng)液干預細胞,CPE法觀察細胞形態(tài)變化,MTT法檢測OD值,計算病毒抑制率,篩選出抗病毒活性最高的藥物血清-DMEM培養(yǎng)液。
6.金葉敗毒顆粒藥物血清對HCMV吸附、穿入、復制影響的實驗研究:將HEL細胞懸液以1×105/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時,利用同步感染法(Synchronized infection assa
6、ys),先后用100TCID50/100ul的HCMV AD169株100ul、抗病毒活性最高的藥物血清-DMEM培養(yǎng)液干預細胞,CPE法觀察細胞形態(tài)變化,MTT法檢測OD值,計算病毒抑制率,評價金葉敗毒顆粒藥物血清抗HCMV感染吸附、穿入、復制三環(huán)節(jié)的活性。
【結(jié)果】1.HCMV AD169毒株半數(shù)細胞感染量為10-3.4/100ul。2.金葉敗毒顆粒藥物血清細胞毒性檢測:①低劑量組藥物血清:分別在灌胃后1h、1.5h、
7、2h、2.5h、3h采血配置的5%、10%藥物血清-DMEM培養(yǎng)液和1h、1.5h采血配置的20%藥物血清-DMEM培養(yǎng)液無細胞毒性,與空白對照組藥物血清比較差異無顯著性意義(p>0.1)。②中劑量組藥物血清:分別在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5%、10%藥物血清-DMEM培養(yǎng)液和1h、1.5h采血配置的20%藥物血清-DMEM培養(yǎng)液無細胞毒性,與空白對照組藥物血清比較差異無顯著性意義(p>0.1)。③高劑量組藥
8、物血清:分別在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5%、10%藥物血清-DMEM培養(yǎng)液和1h采血配置的20%藥物血清-DMEM培養(yǎng)液無細胞毒性,與空白對照組藥物血清比較差異無顯著性意義(p>0.1)。3.金葉敗毒顆粒藥物血清抗病毒活性檢測:①中、高劑量組藥物血清具有較高的抗HCMV作用,與病毒對照組比較差異有顯著性意義(p<0.01),中劑量組、1.5h、5%藥物血清的病毒抑制率達90.90%;②隨時間變化,藥物血清的抗
9、HCMV作用在1.5h、2h兩個采血時相達到高峰,1.5h與2h藥物血清組的抗HCMV作用相當,比較差異無顯著性意義(p>0.1);③采血時相為1.5h、2h時,中、高兩種劑量組藥物血清抗HCMV的作用相當,比較差異無顯著性意義(p>0.1);4.金葉敗毒顆粒藥物血清對HCMV吸附、穿入、復制影響的實驗研究:金葉敗毒顆粒藥物血清抗HCMV感染吸附、穿入、復制三階段的病毒抑制率分別為40.43%、37.55%、88.84%,與病毒對照組比
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