金葉敗毒顆粒藥物血清抗人巨細(xì)胞病毒感染的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【目的】通過四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）法分別檢測金葉敗毒顆粒藥物血清抗人巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染吸附、穿入、復(fù)制三環(huán)節(jié)的活性，探討金葉敗毒顆?？笻CMV感染的作用機(jī)制。
　　 【方法】
　　 1.細(xì)胞懸液法原代培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞（Human embryonic lung fibroblast，HEL）。
　　 2.HCMV AD169毒株體外細(xì)胞培養(yǎng)法傳毒增殖，Reed-Muench法計(jì)算病毒半數(shù)細(xì)胞感染

2、量TCID50。
　　 3.制備金葉敗毒顆粒藥物血清：①將正常成年雌性日本大耳白兔按體重隨機(jī)分為低、中、高劑量組和空白對(duì)照組四組，每組3只；低、中、高劑量組給藥量分別為1.5g/Kg、3g/Kg、6g/Kg，相當(dāng)于成人每次每公斤體重用藥劑量的5倍、10倍、20倍，用溫雙蒸水50ml溶解藥物，空白對(duì)照組給予等體積的雙蒸水；②低、中、高劑量組灌服相應(yīng)劑量金葉敗毒顆粒，空白對(duì)照組灌服等體積的雙蒸水，每天上、下午各一次，連續(xù)3天，第4天

3、上午給藥后1h、1.5h、2h、2.5h、3h于兔耳中央動(dòng)脈采血，血靜置2h,3000rpm離心20min,取上層淡黃色透明樣血清，56℃水浴滅活30min，一次性濾器過濾除菌，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?；③使用前將所需劑量的血清?80℃取出,37℃水浴解凍，用細(xì)胞維持液將藥物血清配置為5％、10％、20％、藥物血清-DMEM培養(yǎng)液。
　　 4.金葉敗毒顆粒藥物血清細(xì)胞毒性檢測：將HEL細(xì)胞懸液以1×105/ml的密度接種于96

4、孔培養(yǎng)板,37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，用各組藥物血清-DMEM培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞，細(xì)胞病變法（Cytopathogenic Effect，CPE）觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測OD值，篩選出無細(xì)胞毒性的藥物血清-DMEN培養(yǎng)液。
　　 5.金葉敗毒顆粒藥物血清抗病毒活性檢測：將HEL細(xì)胞懸液以1×105/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板,37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，先后用100TCID50/100ul的HCMV

5、AD169株100ul、篩選出的無細(xì)胞毒性的藥物血清-DMEM培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞，CPE法觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測OD值，計(jì)算病毒抑制率，篩選出抗病毒活性最高的藥物血清-DMEM培養(yǎng)液。
　　 6.金葉敗毒顆粒藥物血清對(duì)HCMV吸附、穿入、復(fù)制影響的實(shí)驗(yàn)研究：將HEL細(xì)胞懸液以1×105/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板,37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，利用同步感染法（Synchronized infection assa

6、ys），先后用100TCID50/100ul的HCMV AD169株100ul、抗病毒活性最高的藥物血清-DMEM培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞，CPE法觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測OD值，計(jì)算病毒抑制率，評(píng)價(jià)金葉敗毒顆粒藥物血清抗HCMV感染吸附、穿入、復(fù)制三環(huán)節(jié)的活性。
　　 【結(jié)果】1.HCMV AD169毒株半數(shù)細(xì)胞感染量為10-3.4/100ul。2.金葉敗毒顆粒藥物血清細(xì)胞毒性檢測：①低劑量組藥物血清：分別在灌胃后1h、1.5h、

7、2h、2.5h、3h采血配置的5％、10％藥物血清-DMEM培養(yǎng)液和1h、1.5h采血配置的20％藥物血清-DMEM培養(yǎng)液無細(xì)胞毒性，與空白對(duì)照組藥物血清比較差異無顯著性意義（p＞0.1）。②中劑量組藥物血清：分別在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5％、10％藥物血清-DMEM培養(yǎng)液和1h、1.5h采血配置的20％藥物血清-DMEM培養(yǎng)液無細(xì)胞毒性，與空白對(duì)照組藥物血清比較差異無顯著性意義（p＞0.1）。③高劑量組藥

8、物血清：分別在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5％、10％藥物血清-DMEM培養(yǎng)液和1h采血配置的20％藥物血清-DMEM培養(yǎng)液無細(xì)胞毒性，與空白對(duì)照組藥物血清比較差異無顯著性意義（p＞0.1）。3.金葉敗毒顆粒藥物血清抗病毒活性檢測：①中、高劑量組藥物血清具有較高的抗HCMV作用，與病毒對(duì)照組比較差異有顯著性意義（p＜0.01），中劑量組、1.5h、5％藥物血清的病毒抑制率達(dá)90.90％；②隨時(shí)間變化，藥物血清的抗

9、HCMV作用在1.5h、2h兩個(gè)采血時(shí)相達(dá)到高峰，1.5h與2h藥物血清組的抗HCMV作用相當(dāng)，比較差異無顯著性意義（p＞0.1）；③采血時(shí)相為1.5h、2h時(shí)，中、高兩種劑量組藥物血清抗HCMV的作用相當(dāng)，比較差異無顯著性意義（p＞0.1）；4.金葉敗毒顆粒藥物血清對(duì)HCMV吸附、穿入、復(fù)制影響的實(shí)驗(yàn)研究：金葉敗毒顆粒藥物血清抗HCMV感染吸附、穿入、復(fù)制三階段的病毒抑制率分別為40.43％、37.55％、88.84％，與病毒對(duì)照組比