黃芩素抑制人巨細胞病毒感染星形膠質(zhì)細胞的實驗研究.pdf

1、目的:
　　1.觀察黃芩素(baicalein，BAI)抑制HCMV體外感染人星形膠質(zhì)細胞引起的IE、pp65 mRNA及蛋白表達的變化
　　2.探討黃芩素抗HCMV感染的機制
　　方法:
　　1.差速貼壁法純化人原代星形膠質(zhì)細胞;免疫熒光法標記星形膠質(zhì)細胞的標志蛋白—膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，熒光顯微鏡下觀察并計算細胞純度。
　　2.在人

2、胚肺成纖維細胞中擴增HCMV AD169株病毒，采用空斑定量法測定病毒滴度。
　　3.Real-Time PCR和免疫熒光檢測IE、pp65mRNA及蛋白的表達，確定HCMV是否能在人原代星形膠質(zhì)細胞中建立感染模型。
　　4.MTT法檢測BAI組、HCMV組、HCMV+BAI組和對照組細胞的細胞活性，觀察BAI對HCMV感染致人星形膠質(zhì)細胞增殖異常的抑制作用。
　　5.Real-Time PCR檢測不同組間(BAI+H

3、CMV組，HCMV組)星形膠質(zhì)細胞中IE及pp65mRNA的變化。
　　6.免疫熒光和Western blot檢測檢測不同組間（BAI+HCMV組，HCMV組）星形膠質(zhì)細胞中IE、UL84、pp65及乙酰化組蛋白H3K9的變化。
　　結(jié)果:
　　1.分離純化培養(yǎng)得到的人原代星形膠質(zhì)細胞，經(jīng)免疫熒光染色后于倒置顯微鏡下觀察到細胞有較強的特異性紅色熒光，GFAP陽性率大于90％。
　　2.HCMV感染人胚肺成纖維細胞

4、5d左右，超過80％細胞出現(xiàn)典型細胞病變效應(yīng)(CPE)，呈典型的巨細胞病毒感染后的細胞形態(tài)學改變?？瞻邷y定結(jié)果顯示病毒空斑形成單位為1×108 pfu/ml。
　　3.Real-Time PCR和western blot結(jié)果顯示HCMV感染組星形膠質(zhì)細胞可檢測到HCMV-IE和pp65的表達，而未感染組細胞則檢測不到。
　　4.MTT結(jié)果顯示，20μM BAI+HCMV組的吸光值在24 h、48 h、72 h均高于HCMV組

5、(P＜0.05)。
　　5.形態(tài)學觀察病毒感染48 h時，HCMV組細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(yīng)(CPE)，而20μM BAI+HCMV組細胞狀態(tài)較好，CPE不明顯。
　　6.Real-time PCR結(jié)果顯示在感染48 h和72 h時20μM BAI+HCMV組IE、pp65的mRNA表達明顯低于HCMV組(P＜0.05)。
　　7.免疫熒光、Western blot結(jié)果顯示20μM BAI+HCMV組細胞的IE、UL