中藥金葉敗毒制劑體外抗人巨細胞病毒效應(yīng)的實驗研究.pdf

1、人巨細胞病毒(HCMV)在自然界分布廣泛。妊娠期HCMV活動性感染可以通過胎盤垂直傳播，導致宮內(nèi)傳播，引發(fā)流產(chǎn)、死胎、畸形及胎兒生長受限(IUGR)等不良妊娠結(jié)局；胎兒先天性HCMV感染，約有15％新生兒在出生后可發(fā)展為一種或多種神經(jīng)系統(tǒng)異常：如智力發(fā)育遲緩、學習無能、聽力或視力受損，通常出現(xiàn)于出生后1～2年內(nèi)。先天性CMV感染是引起孩子聽力損害的重要原因。大約有1‰嬰兒在出生時出現(xiàn)CMV感染癥狀，這些癥狀有：肝脾腫大、黃疸、顱內(nèi)鈣化和

2、異常皮疹等。這些嬰兒中約20％死亡，幸存者中有90％并有嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷如智力低下、聽力缺陷等遠期后遺癥，嚴重影響人口出生質(zhì)量。 目前國外有學者運用定量PCR技術(shù)檢測母血、羊水等的HCMVDNA量來預(yù)測胎兒感染情況，但結(jié)論及相關(guān)標準尚不確定。在治療方面，現(xiàn)階段國際上通用的更昔洛韋等抗HCMV藥物易引起致畸作用而限制了妊娠期HCMV感染的用藥。國內(nèi)學者通過多年的實驗及臨床研究發(fā)現(xiàn)中藥金葉敗毒制劑具有抗病毒、提高機體免疫力的作

3、用，可有效拮抗HCMV感染，表現(xiàn)為與更昔洛韋相當?shù)目共《咀饔?，且無明顯的毒副作用。作為中藥復合制劑，金葉敗毒制劑作用靶點眾多，機理復雜，其確切的分子作用機制尚待進一步闡明。 基于上述研究現(xiàn)狀，本課題采用體外實驗方法，探討中藥金葉敗毒制劑體外抗病毒效應(yīng)及與HCMV感染細胞的病變及增殖活性的相關(guān)性，并從病毒蛋白激酶pul97基因表達、受染細胞內(nèi)CyclinD1、CDK4、P16蛋白表達及對細胞周期和凋亡的影響等方面研究中醫(yī)藥金葉敗毒

4、制劑抗HCMV感染的作用機理，以對妊娠期HCMV感染的致病機制及其治療有所提示。 第一部分中藥金葉敗毒制劑體外抗病毒效應(yīng)的實驗研究 目的:研究中藥金葉敗毒制劑抗HCMVAD169感染的效應(yīng)。 方法:采用細胞病變(CPE)抑制法觀察不同濃度GCV和金葉敗毒制劑對HCMVAD169毒株的抑制作用；應(yīng)用MTT法檢測細胞的損傷程度，并利用A值評價兩種藥物不同濃度下的抗HCMV病毒效應(yīng)。 結(jié)果:金葉敗毒制劑的半數(shù)中

5、毒濃度(TD50)為16mg/ml，半數(shù)有效濃度(IC50)為4mg/ml，治療指數(shù)(TI)為4；GCV的TD50為100μg/ml，IC50為25μg/ml，TI為4。金葉敗毒制劑具有抗病毒作用，且隨濃度的增高其作用也增強，其抗HCMV作用與GCV相當，差異無顯著性。 結(jié)論:中藥金葉敗毒制劑在4mg/ml濃度時對病毒的增殖具有較強的抑制作用，是理想的抗HCMV中藥。 第二部分中藥金葉敗毒制劑抑制人巨細胞病毒蛋白

6、激酶pul97的實驗研究 目的:研究中藥金葉敗毒制劑對人巨細胞病毒(HCMV)蛋白激酶pul97的抑制作用，探討其治療HCMV感染的分子機制。 方法:利用倒置顯微鏡觀察中藥金葉敗毒制劑和更昔洛韋(GCV)對HCMV感染人胚肺成纖維細胞(HEL)細胞病變(CPE)的影響，應(yīng)用MTT法觀察兩種藥物對感染細胞增殖活性的影響，并采用半定量RT-PCR方法，檢測兩種藥物干預(yù)后感染細胞HCMVpul97mRNA表達水平。 結(jié)

7、果:金葉敗毒制劑能明顯延緩感染細胞的細胞病變，在HCMV感染72h后可明顯增強感染細胞的增殖活性，其對HCMVpul97mRNA的抑制作用在HCMV感染12h后就已出現(xiàn)，感染24～48h抑制作用達到高峰。 結(jié)論:金葉敗毒制劑可能通過抑制HCMV蛋白激酶pul97基因的表達而抑制HCMV的表達和復制，從而延緩感染細胞的細胞病變，促進感染細胞的增殖而達到抗病毒作用。 第三部分中藥金葉敗毒制劑對人巨細胞病毒感染細胞C

8、yclinD1、CDK4、P16蛋白表達調(diào)控的實驗研究 目的:研究中藥金葉敗毒制劑干預(yù)后HCMV感染細胞CyclinD1、CDK4、P16的表達調(diào)節(jié)，探討中藥金葉敗毒制劑抗HCMV感染的作用機制。 方法:用HCMVAD169感染人胚肺成纖維細胞，應(yīng)用半定量RT-PCR方法，檢測中藥金葉敗毒制劑和更昔洛韋(GCV)干預(yù)后感染細胞cyclinD1mRNA及細胞周期素依賴激酶4(CDK4)mRNA的表達水平。同時應(yīng)用免疫組織化

9、學的方法分別檢測兩種藥物干預(yù)后感染細胞cyclinD1、細胞周期素依賴激酶4(CDK4)及P16蛋白的表達水平。 結(jié)果:HCMV感染后，宿主細胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1和CDK4的表達水平逐漸降低；而金葉敗毒制劑干預(yù)后，在HCMV感染12h后就出現(xiàn)兩種蛋白的表達增強，在感染48～96h后作用達高峰。在HCMV感染24～48h內(nèi)，P16蛋白的表達較弱，在感染72～96h后P16蛋白表達達高峰；而金葉敗毒制劑干預(yù)后，在感染12～

10、24h未見P16蛋白表達，感染48～72h后P16蛋白的表達仍較弱。 結(jié)論:金葉敗毒制劑可能通過促進HCMV感染細胞cyclinD1及CDK4的表達，抑制P16蛋白的表達，促進宿主細胞增殖而發(fā)揮抗病毒作用。 第四部分中藥金葉敗毒制劑對人巨細胞病毒感染宿主細胞周期和凋亡的影響的實驗研究 目的:探討中藥金葉敗毒制劑對人巨細胞病毒(HCMV)感染宿主細胞周期和凋亡的影響。 方法:用HCMVAD169感

11、染人胚肺成纖維細胞，分別用金葉敗毒制劑和更昔洛韋干預(yù)后，采用流式細胞技術(shù)對HCMV感染及藥物干預(yù)后宿主細胞進行細胞周期和凋亡分析。 結(jié)果:HCMV感染48h后宿主細胞的G0/G1期細胞明顯減少，S及G2/M期細胞明顯增多。而經(jīng)金葉敗毒制劑干預(yù)后，在HCMV感染48h后宿主細胞的G0/G1期細胞增多，S及G2/M期細胞減少。在HCMV感染48h后，凋亡細胞數(shù)顯著增加，且隨感染時間延長，細胞凋亡數(shù)逐漸增加；經(jīng)金葉敗毒制劑干預(yù)后，對細