中藥金葉敗毒制劑體外抗人巨細(xì)胞病毒效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)在自然界分布廣泛。妊娠期HCMV活動(dòng)性感染可以通過胎盤垂直傳播，導(dǎo)致宮內(nèi)傳播，引發(fā)流產(chǎn)、死胎、畸形及胎兒生長(zhǎng)受限(IUGR)等不良妊娠結(jié)局；胎兒先天性HCMV感染，約有15％新生兒在出生后可發(fā)展為一種或多種神經(jīng)系統(tǒng)異常：如智力發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)無(wú)能、聽力或視力受損，通常出現(xiàn)于出生后1～2年內(nèi)。先天性CMV感染是引起孩子聽力損害的重要原因。大約有1‰嬰兒在出生時(shí)出現(xiàn)CMV感染癥狀，這些癥狀有：肝脾腫大、黃疸、顱內(nèi)鈣化和

2、異常皮疹等。這些嬰兒中約20％死亡，幸存者中有90％并有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷如智力低下、聽力缺陷等遠(yuǎn)期后遺癥，嚴(yán)重影響人口出生質(zhì)量。 目前國(guó)外有學(xué)者運(yùn)用定量PCR技術(shù)檢測(cè)母血、羊水等的HCMVDNA量來(lái)預(yù)測(cè)胎兒感染情況，但結(jié)論及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚不確定。在治療方面，現(xiàn)階段國(guó)際上通用的更昔洛韋等抗HCMV藥物易引起致畸作用而限制了妊娠期HCMV感染的用藥。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過多年的實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)中藥金葉敗毒制劑具有抗病毒、提高機(jī)體免疫力的作

3、用，可有效拮抗HCMV感染，表現(xiàn)為與更昔洛韋相當(dāng)?shù)目共《咀饔?，且無(wú)明顯的毒副作用。作為中藥復(fù)合制劑，金葉敗毒制劑作用靶點(diǎn)眾多，機(jī)理復(fù)雜，其確切的分子作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。 基于上述研究現(xiàn)狀，本課題采用體外實(shí)驗(yàn)方法，探討中藥金葉敗毒制劑體外抗病毒效應(yīng)及與HCMV感染細(xì)胞的病變及增殖活性的相關(guān)性，并從病毒蛋白激酶pul97基因表達(dá)、受染細(xì)胞內(nèi)CyclinD1、CDK4、P16蛋白表達(dá)及對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響等方面研究中醫(yī)藥金葉敗毒

4、制劑抗HCMV感染的作用機(jī)理，以對(duì)妊娠期HCMV感染的致病機(jī)制及其治療有所提示。 第一部分中藥金葉敗毒制劑體外抗病毒效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究 目的:研究中藥金葉敗毒制劑抗HCMVAD169感染的效應(yīng)。 方法:采用細(xì)胞病變(CPE)抑制法觀察不同濃度GCV和金葉敗毒制劑對(duì)HCMVAD169毒株的抑制作用；應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的損傷程度，并利用A值評(píng)價(jià)兩種藥物不同濃度下的抗HCMV病毒效應(yīng)。 結(jié)果:金葉敗毒制劑的半數(shù)中

5、毒濃度(TD50)為16mg/ml，半數(shù)有效濃度(IC50)為4mg/ml，治療指數(shù)(TI)為4；GCV的TD50為100μg/ml，IC50為25μg/ml，TI為4。金葉敗毒制劑具有抗病毒作用，且隨濃度的增高其作用也增強(qiáng)，其抗HCMV作用與GCV相當(dāng)，差異無(wú)顯著性。 結(jié)論:中藥金葉敗毒制劑在4mg/ml濃度時(shí)對(duì)病毒的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，是理想的抗HCMV中藥。 第二部分中藥金葉敗毒制劑抑制人巨細(xì)胞病毒蛋白

6、激酶pul97的實(shí)驗(yàn)研究 目的:研究中藥金葉敗毒制劑對(duì)人巨細(xì)胞病毒(HCMV)蛋白激酶pul97的抑制作用，探討其治療HCMV感染的分子機(jī)制。 方法:利用倒置顯微鏡觀察中藥金葉敗毒制劑和更昔洛韋(GCV)對(duì)HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL)細(xì)胞病變(CPE)的影響，應(yīng)用MTT法觀察兩種藥物對(duì)感染細(xì)胞增殖活性的影響，并采用半定量RT-PCR方法，檢測(cè)兩種藥物干預(yù)后感染細(xì)胞HCMVpul97mRNA表達(dá)水平。 結(jié)

7、果:金葉敗毒制劑能明顯延緩感染細(xì)胞的細(xì)胞病變，在HCMV感染72h后可明顯增強(qiáng)感染細(xì)胞的增殖活性，其對(duì)HCMVpul97mRNA的抑制作用在HCMV感染12h后就已出現(xiàn)，感染24～48h抑制作用達(dá)到高峰。 結(jié)論:金葉敗毒制劑可能通過抑制HCMV蛋白激酶pul97基因的表達(dá)而抑制HCMV的表達(dá)和復(fù)制，從而延緩感染細(xì)胞的細(xì)胞病變，促進(jìn)感染細(xì)胞的增殖而達(dá)到抗病毒作用。 第三部分中藥金葉敗毒制劑對(duì)人巨細(xì)胞病毒感染細(xì)胞C

8、yclinD1、CDK4、P16蛋白表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究 目的:研究中藥金葉敗毒制劑干預(yù)后HCMV感染細(xì)胞CyclinD1、CDK4、P16的表達(dá)調(diào)節(jié)，探討中藥金葉敗毒制劑抗HCMV感染的作用機(jī)制。 方法:用HCMVAD169感染人胚肺成纖維細(xì)胞，應(yīng)用半定量RT-PCR方法，檢測(cè)中藥金葉敗毒制劑和更昔洛韋(GCV)干預(yù)后感染細(xì)胞cyclinD1mRNA及細(xì)胞周期素依賴激酶4(CDK4)mRNA的表達(dá)水平。同時(shí)應(yīng)用免疫組織化

9、學(xué)的方法分別檢測(cè)兩種藥物干預(yù)后感染細(xì)胞cyclinD1、細(xì)胞周期素依賴激酶4(CDK4)及P16蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果:HCMV感染后，宿主細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1和CDK4的表達(dá)水平逐漸降低；而金葉敗毒制劑干預(yù)后，在HCMV感染12h后就出現(xiàn)兩種蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，在感染48～96h后作用達(dá)高峰。在HCMV感染24～48h內(nèi)，P16蛋白的表達(dá)較弱，在感染72～96h后P16蛋白表達(dá)達(dá)高峰；而金葉敗毒制劑干預(yù)后，在感染12～

10、24h未見P16蛋白表達(dá)，感染48～72h后P16蛋白的表達(dá)仍較弱。 結(jié)論:金葉敗毒制劑可能通過促進(jìn)HCMV感染細(xì)胞cyclinD1及CDK4的表達(dá)，抑制P16蛋白的表達(dá)，促進(jìn)宿主細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗病毒作用。 第四部分中藥金葉敗毒制劑對(duì)人巨細(xì)胞病毒感染宿主細(xì)胞周期和凋亡的影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討中藥金葉敗毒制劑對(duì)人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染宿主細(xì)胞周期和凋亡的影響。 方法:用HCMVAD169感

11、染人胚肺成纖維細(xì)胞，分別用金葉敗毒制劑和更昔洛韋干預(yù)后，采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)HCMV感染及藥物干預(yù)后宿主細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡分析。 結(jié)果:HCMV感染48h后宿主細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞明顯減少，S及G2/M期細(xì)胞明顯增多。而經(jīng)金葉敗毒制劑干預(yù)后，在HCMV感染48h后宿主細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞增多，S及G2/M期細(xì)胞減少。在HCMV感染48h后，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加，且隨感染時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增加；經(jīng)金葉敗毒制劑干預(yù)后，對(duì)細(xì)