人巨細胞病毒感染小鼠大腦皮質(zhì)細胞的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、目的：研究人巨細胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)在體外可以增殖性感染新生小鼠大腦皮質(zhì)細胞；在體內(nèi)可以先天性潛伏感染小鼠大腦皮質(zhì)細胞，并且可以被再激活。 方法：體外試驗：選用HCMVAD169株和3株HCMV臨床分離株作為本次實驗的毒種，并設(shè)立經(jīng)高溫滅活后HCMVAD169株對照組。對所有毒株進行50％組織細胞感染量(TCID50)測定，然后在長成單層的Balb/c新生小鼠的大腦皮質(zhì)細胞和HF細胞6孔板

2、上分別接種相同滴度的病毒懸液0.1ml/孔。逐日鏡下觀察HCMV特征性細胞致病變效應(yīng)(CPE)，同時采用PCR、RT-PCR、間接免疫熒光檢測HCMV特異性基因IE和UL83的復制和蛋白表達，確定HCMV感染狀態(tài)。分別在感染后第1、2、3、4、5天收集細胞及其培養(yǎng)上清液，采用TCID50法檢測被感染的新生小鼠大腦皮質(zhì)細胞培養(yǎng)物上清的病毒滴度，每種病毒標本分兩組，每組重復三次；并且在不同的時間點固定細胞片進行HCMV特異性早期蛋白和pp6

3、5蛋白免疫熒光檢測；透射電鏡觀察大腦皮質(zhì)細胞內(nèi)HCMV病毒顆粒。體內(nèi)試驗：利用己建立的HCMV先天性潛伏感染的小鼠模型。試驗分為三組：HCMV先天潛伏感染組、HCMV先天性潛伏感染再激活組(小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg，每6天1次，共3次)、HF細胞對照組小鼠。在各組小鼠達18～20月齡時，分別在各組隨機選取小鼠5只。取HCMV先天性潛伏感染組、HCMV先天性潛伏感染再激活組小鼠和HF細胞對照組小鼠大腦皮質(zhì)細胞與HF細胞建立共培

4、養(yǎng)體系。利用PCR、RT-PCR、間接免疫熒光檢測HCMV特異性基因IE和UL83的復制和蛋白表達。 結(jié)果：體外試驗研究：將TCID50為1.7×103/mlHCMVAD169株病毒懸液接種在新生小鼠大腦皮質(zhì)細胞培養(yǎng)物上，在感染后第2天可見神經(jīng)細胞形態(tài)明顯改變：鏡下觀察時可見神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞核腫脹，胞漿顆粒增多，折光性增強，軸突斷裂，細胞固縮等CPE。3株HCMV臨床分離株以TCID50為1.7×103/ml的病毒量接種在小鼠大

5、腦皮質(zhì)細胞培養(yǎng)物上，其中只有1株出現(xiàn)與HCMVAD169株類似的病變，其余2株與接種滅活病毒組均未見CPE。HCMVAD169株和3株HCMV臨床分離株均可感染HF細胞出現(xiàn)CPE。在感染后第1、2、3、4、5天收集細胞及其培養(yǎng)上清液，進行TCID50測定。在感染后第1天小鼠大腦皮質(zhì)細胞培養(yǎng)物上清液中游離病毒TCID50滴度為1.27×103/ml;于感染后第2天，病毒效價開始增高達4.95×103/ml，這與出現(xiàn)的CPE變化相一致。同樣

6、的，HCMV臨床分離株感染的新生小鼠鼠大腦皮質(zhì)細胞培養(yǎng)物，在感染后第1天TCID50分別為0.9×103/ml，感染后第2天，病毒效價開始增高達4.11×103/ml。統(tǒng)計學分析，每種病毒標本的兩組試驗結(jié)果無顯著性差別。同時，用HCMV早期蛋白、pp65蛋白單克隆抗體對HCMV感染的新生小鼠大腦皮質(zhì)細胞培養(yǎng)物進行免疫熒光檢測，均可見蘋果綠色熒光陽性信號位于被病毒感染的神經(jīng)細胞的細胞核中，并且隨著培養(yǎng)時間的延長熒光信號逐漸增強，胞核、胞漿

7、內(nèi)均出現(xiàn)熒光信號。鏡下計算每種病毒抗原陽性細胞的百分率(≥10個視野)，在感染后第2天，陽性細胞數(shù)量達到最高，與病毒滴度結(jié)果一致。PCR和RT-PCR結(jié)果均為陽性。透射電鏡下觀察在HCMV感染的新生小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞胞漿中可見病毒顆粒。體內(nèi)試驗研究：HCMV先天性潛伏感染組小鼠和HCMV先天性潛伏感染再激活組小鼠大腦皮質(zhì)細胞與HF細胞共培養(yǎng)后3周內(nèi)，HCMV先天性潛伏感染組小鼠和HCMV先天性潛伏感染再激活組小鼠共培養(yǎng)體系中均可在HF

8、細胞上觀察到HCMV特征性CPE。HF細胞對照組共培養(yǎng)體系盲傳三代后無CPE出現(xiàn)。出現(xiàn)CPE的細胞培養(yǎng)物PCR和RT-PCR結(jié)果均為陽性，間接免疫熒光檢測可見蘋果綠色熒光陽性信號位于細胞核中。透射電鏡下觀察在HCMV先天性潛伏感染再激活小鼠的大腦皮質(zhì)組織中可見神經(jīng)元組織構(gòu)筑破壞嚴重，細胞器均有不同程度損傷，并發(fā)現(xiàn)典型的皰疹病毒樣顆粒及病毒包涵體。 結(jié)論：通過對病毒效價和病毒抗原表達的動態(tài)檢測，證明了HCMV可以增殖性感染體外培養(yǎng)