人巨細(xì)胞病毒感染小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)在體外可以增殖性感染新生小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞；在體內(nèi)可以先天性潛伏感染小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞，并且可以被再激活。 方法：體外試驗(yàn)：選用HCMVAD169株和3株HCMV臨床分離株作為本次實(shí)驗(yàn)的毒種，并設(shè)立經(jīng)高溫滅活后HCMVAD169株對(duì)照組。對(duì)所有毒株進(jìn)行50％組織細(xì)胞感染量(TCID50)測(cè)定，然后在長(zhǎng)成單層的Balb/c新生小鼠的大腦皮質(zhì)細(xì)胞和HF細(xì)胞6孔板

2、上分別接種相同滴度的病毒懸液0.1ml/孔。逐日鏡下觀察HCMV特征性細(xì)胞致病變效應(yīng)(CPE)，同時(shí)采用PCR、RT-PCR、間接免疫熒光檢測(cè)HCMV特異性基因IE和UL83的復(fù)制和蛋白表達(dá)，確定HCMV感染狀態(tài)。分別在感染后第1、2、3、4、5天收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液，采用TCID50法檢測(cè)被感染的新生小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物上清的病毒滴度，每種病毒標(biāo)本分兩組，每組重復(fù)三次；并且在不同的時(shí)間點(diǎn)固定細(xì)胞片進(jìn)行HCMV特異性早期蛋白和pp6

3、5蛋白免疫熒光檢測(cè)；透射電鏡觀察大腦皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HCMV病毒顆粒。體內(nèi)試驗(yàn)：利用己建立的HCMV先天性潛伏感染的小鼠模型。試驗(yàn)分為三組：HCMV先天潛伏感染組、HCMV先天性潛伏感染再激活組(小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg，每6天1次，共3次)、HF細(xì)胞對(duì)照組小鼠。在各組小鼠達(dá)18～20月齡時(shí)，分別在各組隨機(jī)選取小鼠5只。取HCMV先天性潛伏感染組、HCMV先天性潛伏感染再激活組小鼠和HF細(xì)胞對(duì)照組小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞與HF細(xì)胞建立共培

4、養(yǎng)體系。利用PCR、RT-PCR、間接免疫熒光檢測(cè)HCMV特異性基因IE和UL83的復(fù)制和蛋白表達(dá)。 結(jié)果：體外試驗(yàn)研究：將TCID50為1.7×103/mlHCMVAD169株病毒懸液接種在新生小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物上，在感染后第2天可見神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)明顯改變：鏡下觀察時(shí)可見神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞核腫脹，胞漿顆粒增多，折光性增強(qiáng)，軸突斷裂，細(xì)胞固縮等CPE。3株HCMV臨床分離株以TCID50為1.7×103/ml的病毒量接種在小鼠大

5、腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物上，其中只有1株出現(xiàn)與HCMVAD169株類似的病變，其余2株與接種滅活病毒組均未見CPE。HCMVAD169株和3株HCMV臨床分離株均可感染HF細(xì)胞出現(xiàn)CPE。在感染后第1、2、3、4、5天收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液，進(jìn)行TCID50測(cè)定。在感染后第1天小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中游離病毒TCID50滴度為1.27×103/ml;于感染后第2天，病毒效價(jià)開始增高達(dá)4.95×103/ml，這與出現(xiàn)的CPE變化相一致。同樣

6、的，HCMV臨床分離株感染的新生小鼠鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，在感染后第1天TCID50分別為0.9×103/ml，感染后第2天，病毒效價(jià)開始增高達(dá)4.11×103/ml。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每種病毒標(biāo)本的兩組試驗(yàn)結(jié)果無顯著性差別。同時(shí)，用HCMV早期蛋白、pp65蛋白單克隆抗體對(duì)HCMV感染的新生小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，均可見蘋果綠色熒光陽(yáng)性信號(hào)位于被病毒感染的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞核中，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，胞核、胞漿

7、內(nèi)均出現(xiàn)熒光信號(hào)。鏡下計(jì)算每種病毒抗原陽(yáng)性細(xì)胞的百分率(≥10個(gè)視野)，在感染后第2天，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高，與病毒滴度結(jié)果一致。PCR和RT-PCR結(jié)果均為陽(yáng)性。透射電鏡下觀察在HCMV感染的新生小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞胞漿中可見病毒顆粒。體內(nèi)試驗(yàn)研究：HCMV先天性潛伏感染組小鼠和HCMV先天性潛伏感染再激活組小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞與HF細(xì)胞共培養(yǎng)后3周內(nèi)，HCMV先天性潛伏感染組小鼠和HCMV先天性潛伏感染再激活組小鼠共培養(yǎng)體系中均可在HF

8、細(xì)胞上觀察到HCMV特征性CPE。HF細(xì)胞對(duì)照組共培養(yǎng)體系盲傳三代后無CPE出現(xiàn)。出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物PCR和RT-PCR結(jié)果均為陽(yáng)性，間接免疫熒光檢測(cè)可見蘋果綠色熒光陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞核中。透射電鏡下觀察在HCMV先天性潛伏感染再激活小鼠的大腦皮質(zhì)組織中可見神經(jīng)元組織構(gòu)筑破壞嚴(yán)重，細(xì)胞器均有不同程度損傷，并發(fā)現(xiàn)典型的皰疹病毒樣顆粒及病毒包涵體。 結(jié)論：通過對(duì)病毒效價(jià)和病毒抗原表達(dá)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，證明了HCMV可以增殖性感染體外培養(yǎng)