shRNA沉默RPS14基因?qū)DS細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndrome，MDS)是一組起源于多能造血干/祖細(xì)胞的異質(zhì)性惡性血液疾病，以高風(fēng)險(xiǎn)向急性白血病轉(zhuǎn)化為其特征，故又俗稱白血病前期(Preleukemia，PL)。目前本病的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，缺乏有效的治療手段。因此，探索MDS的分子發(fā)病機(jī)制，尋找MDS的有效治療手段具有重要意義。MDS最常見(jiàn)的染色體缺失是5號(hào)染色體長(zhǎng)臂的缺失，所有伴有del(5q)的MDS患者染色體缺失區(qū)域均含

2、有5q31-5q32區(qū)帶，稱為共缺失區(qū)域(common delete region，CDR)。對(duì)CDR的基因測(cè)序研究未發(fā)現(xiàn)顯性突變，均表現(xiàn)為基因表達(dá)量的下降。其中，位于該區(qū)域的RPS14基因，是單倍劑量減少的抑癌基因，近年研究表明，伴有del(5q)的MDS患者體內(nèi)RPS14基因表達(dá)水平下降。而對(duì)于5號(hào)染色體表型正常的MDS患者體內(nèi)RPS14基因表達(dá)變化是否也具有同樣的意義目前尚未有研究報(bào)道。因此，研究RPS14在MDS發(fā)生發(fā)展中的作用

3、具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建RPS14基因RNAi慢病毒載體(Lentiviral Vector，LV)，觀察該基因在人MDS細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞中的表達(dá)，并將構(gòu)建成功的重組慢病毒載體RPS14-shRNA轉(zhuǎn)染人MDS細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞，使目的基因在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)沉默。以便深入研究RPS14基因?qū)DS細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)行為的影響。通過(guò)細(xì)胞增殖率變化等方法觀察RPS14基因表達(dá)沉默后對(duì)SKM-1細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：
　　1

4、、RPS14基因RNAi慢病毒載體RPS14-shRNA的構(gòu)建及鑒定：選用新型慢病毒載體pGC-SIL-GFP，首先設(shè)計(jì)合成RPS14互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary deoxynucleic acid，cDNA)的PCR產(chǎn)物與線性化慢病毒載體相連接，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定確認(rèn)，與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，產(chǎn)生重組慢病毒載體RPS14-shRNA，逐孔稀釋法測(cè)定病毒滴度；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染

5、前后目的細(xì)胞內(nèi)RPS14蛋白的表達(dá)變化。
　　2、重組慢病毒載體RPS14-shRNA轉(zhuǎn)染SKM-1細(xì)胞后對(duì)其增殖影響的研究：將重組慢病毒載體RPS14-shRNA轉(zhuǎn)染SKM-1細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組)，同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染組(SKM-1)、空載體轉(zhuǎn)染組，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定各組細(xì)胞的光密度值(Optical density，OD)。
　　結(jié)果：
　　1、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組慢病毒載體RPS14-shRNA，滴度達(dá)2.0

6、×102TU/ml，構(gòu)建的慢病毒載體能夠高效率的轉(zhuǎn)染SKM-1細(xì)胞，100感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)的重組慢病毒載體對(duì)SKM-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率約為58.26％，Western blot檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染后靶細(xì)胞RPS14蛋白的表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染前，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2、重組慢病毒載體RPS14-shRNA轉(zhuǎn)染SKM-1細(xì)胞后抑制其增殖：轉(zhuǎn)染48h、72h

7、、96h，收集各組細(xì)胞，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值，轉(zhuǎn)染重組慢病毒載體后對(duì)SKM-1細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，與空載體轉(zhuǎn)染組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、慢病毒載體可以高效率的轉(zhuǎn)染血液腫瘤細(xì)胞，對(duì)血液腫瘤的分子治療具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　2、對(duì)于5號(hào)染色體表型正常的MDS細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞RPS14基因表達(dá)沉默可抑制其增值。
　　3、本研究結(jié)果表明RPS14基因在MDS的發(fā)生發(fā)展