地西他濱聯(lián)合三氧化二砷在SKM-1細(xì)胞株中的協(xié)同作用研究.pdf

1、背景:
　　 骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一組起源于造血干/祖細(xì)胞的異質(zhì)性克隆性疾病，其疾病特點(diǎn)為全血細(xì)胞減少、病態(tài)造血和高風(fēng)險(xiǎn)向急性髓性白血病轉(zhuǎn)化。骨髓異常增生綜合征的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，可能與分子遺傳、造血微環(huán)境改變、造血干/祖細(xì)胞增殖和凋亡紊亂、免疫缺陷、及抑癌基因甲基化等多種因素有關(guān)。目前，骨髓增生異常綜合征患者多為老年患者，因此傳統(tǒng)化療方法和造血干細(xì)胞移植并不廣

2、泛適用。
　　 表觀遺傳學(xué)是指非基因序列改變導(dǎo)致的基因表達(dá)水平的變化，主要是通過DNA甲基化、組蛋白乙酰化等發(fā)揮作用。許多腫瘤細(xì)胞抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)存在高度甲基化，從而使抑癌基因表達(dá)降低，這有可能是腫瘤發(fā)生的重要原因。因此去甲基化藥物地西他濱成為近年來(lái)骨髓增生異常綜合征研究的熱點(diǎn)。
　　 地西他濱是一種胞嘧啶類似物，能通過抑制體內(nèi)甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT而發(fā)揮作用，從而使甲基化的抑癌基因重新表達(dá)而發(fā)揮作用，達(dá)到治療腫瘤的目的

3、。起初，地西他濱是作為白血病和實(shí)體腫瘤的傳統(tǒng)化療藥物而加以研究。在這些研究中，地西他濱的用藥劑量1500～2500mg/m2，但是引起了嚴(yán)重的骨髓抑制，于是這種藥物的高劑量應(yīng)用的進(jìn)一步研究被終止。直到1980年，Jones和Taylor發(fā)現(xiàn)低劑量的地西他濱和5-AZA具有逆轉(zhuǎn)DNA甲基化和細(xì)胞分化的潛能，才又重新開始了對(duì)地西他濱低劑量應(yīng)用的一系列研究。通過研究已經(jīng)證實(shí)，地西他濱應(yīng)具有雙重作用機(jī)制，即高濃度時(shí)的細(xì)胞毒作用和低濃度是的去甲基

4、化作用。一系列應(yīng)用低劑量地西他濱治療MDS的臨床試驗(yàn)，取得了比傳統(tǒng)療法更好的療效，且毒副作用較小，患者可以耐受。但是患者完全緩解率仍然較低，療效具有一定的局限性。
　　 砷為體內(nèi)的一種微量元素，微量的三氧化二砷能夠刺激造血、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。三氧化二砷進(jìn)入人體后，主要在肝臟進(jìn)行代謝，在5‘-甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，從S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到砷分子上，形成一甲胂酸(MMOL/LA)或二甲胂酸(DMA)被解毒。三氧化二砷也具有雙

5、重作用機(jī)制，高濃度時(shí)誘導(dǎo)凋亡為主，低濃度是則以誘導(dǎo)分化為主。研究表明，ATO可以通過調(diào)節(jié)Bcl2家族中促凋亡與抗凋亡蛋白的表達(dá)，激活其中的促凋亡基因Bax使其表達(dá)增加，同時(shí)下調(diào)抗凋亡基因Bcl2的表達(dá)，此外還可釋放細(xì)胞色素C并使線粒體跨膜潛能喪失并促進(jìn)活性氧化物的生成等途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。三氧化二砷還可通過抑制谷胱甘肽過氧化氫酶的活性和半胱天冬酶活性，抑制NF-Kβ活性來(lái)促進(jìn)凋亡。由于三氧化二砷在細(xì)胞內(nèi)代謝時(shí)會(huì)消耗甲基的主要原料s-腺苷甲

6、硫氨酸(SAM)，同時(shí)消耗甲基化轉(zhuǎn)移酶，而SAM又是細(xì)胞內(nèi)甲基化轉(zhuǎn)移酶所必需的活性因子，因此三氧化二砷在代謝過程既消耗了甲基化所需的原料同時(shí)又是甲基化轉(zhuǎn)移酶的數(shù)量和活性減低，有可能也發(fā)揮著去甲基化作用。Tong等和Fu等將三氧化二砷分別應(yīng)用于在白血病的U266細(xì)胞株和MUTZ-1細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)其可以通過其啟動(dòng)子的去甲基化而使P15和P16重新表達(dá)。Hussein M等將三氧化二砷和同為去甲基化藥物的阿扎胞苷聯(lián)合應(yīng)用于骨髓瘤的體內(nèi)和體外實(shí)

7、驗(yàn)，結(jié)果表明二者聯(lián)用后的去甲基化作用增加，也提示三氧化二砷與地西他濱的聯(lián)用有可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同的作用。
　　 因此，地西他濱與三氧化二砷同時(shí)都具有去甲基化的作用。二者去甲基化的機(jī)制既有相同的一面，即抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，又有不同的方面，三氧化二砷代謝過程中可以消耗甲基的供體，而地西他濱則不能通過消耗甲基供體而發(fā)揮去甲基化作用。兩種藥物的聯(lián)合應(yīng)用有可能使細(xì)胞的去甲基化作用增強(qiáng)。這為兩者的聯(lián)合應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
　　 地西他

8、濱或三氧化二砷單藥用于惡性血液疾病的治療，患者應(yīng)用后副作用較傳統(tǒng)化療小，比較適用于老年骨髓增生異常綜合征的治療，但由于其完全緩解率較低，療效有一定的局限性。臨床上，以地西他賓或三氧化二砷為基礎(chǔ)與其他藥物如維生素C、丙戊酸等聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其副作用并無(wú)明顯增加。且地西他濱與三氧化二砷的聯(lián)用有可能在腫瘤細(xì)胞去甲基化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方面具有協(xié)同作用，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)地西他濱與三氧化二砷在SKM-1細(xì)胞株中的研究報(bào)道，因此對(duì)于骨髓增生異常綜合征患者治療新

9、方法的探索具有非常積極的意義。
　　 本研究應(yīng)用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)用MTS、流式細(xì)胞技術(shù)及實(shí)時(shí)定量PCR的方法，對(duì)地西他濱與三氧化二砷的在SKM-1細(xì)胞株的協(xié)同作用進(jìn)行了初步研究。并應(yīng)用Calcusyn軟件對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行分析，calcusyn軟件是基于中效原理專門用于計(jì)算藥物協(xié)同作用的軟件，當(dāng)計(jì)算得CI＜1，說(shuō)明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用;CI=1，則說(shuō)明兩藥聯(lián)合是相加作用:CI＞1，說(shuō)明兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有拮抗作用。
　　

10、 目的:研究地西他濱與三氧化二砷在SKM-1細(xì)胞株中聯(lián)合應(yīng)用的效應(yīng)，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用MTS方法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)，藥物IC50及兩藥聯(lián)合協(xié)同指數(shù)根據(jù)中效原理應(yīng)用Calcusyn軟件計(jì)算;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)Annexin v-PE/7-AAD檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期;應(yīng)用SYBR Green熒光定量PCR方法檢測(cè)Bcl2、Bax的基因表達(dá);
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞增殖效應(yīng)檢

11、測(cè):地西他濱和三氧化二砷對(duì)SKM-1細(xì)胞均有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性，地西他濱對(duì)SKM-1細(xì)胞的IC50為1.42(95％可信區(qū)間:1.08～1.86，r=0.97)μmol/L，三氧化二砷作用于SKM-1細(xì)胞的IC50為3.82（95％可信區(qū)間:3.22～4.53，r=0.99）μmol/L。兩藥聯(lián)用協(xié)同指數(shù)CI值介于0.280～0.581(r=0.97)
　　 2.細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期檢測(cè):對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為3.43±

12、0.58％，地西他濱2.5、5μmol/L作用后凋亡率分別為4.0±0.69％、4.13±0.99％，與對(duì)照組相比無(wú)明顯增加(P=0.534);三氧化二砷5、10μmol/L濃度下細(xì)胞凋亡率逐漸升高，分別為12.55±0.42％、61.89±12.94％。隨著地西他濱藥物濃度的增加，G2/M期細(xì)胞比例明顯增多上(P＜0.001)。2.5μmol/L地西他濱與5μmol/L三氧化二砷聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞凋亡率為22.71±1.41％，能夠使細(xì)胞凋

13、亡比率增加(P＜0.001)。
　　 3.細(xì)胞BCL2/BAX相對(duì)表達(dá)量檢測(cè):將從不同濃度藥物作用48小時(shí)后的SKM-1細(xì)胞中提取RNA，并合成CDNA，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)地西他濱和三氧化二砷單藥作用后，BCL2/BAX比值降低，4和8μmol/L地西他濱濃度下，BCL2/BAX比值降低分別為0.3065±0.0142、0.1686±0.0014，隨地西他濱濃度增多而逐漸降低，(P＜0.001

14、)。1.6、3.2μmol/L三氧化二砷濃度下，BCL2/BAX比值降低分別為0.5615±0.0256、0.2798±0.0166，隨三氧化二砷濃度濃度增多而逐漸降低(P＜0.001)，兩藥聯(lián)合應(yīng)用較單藥作用下降更明顯，地西他濱4μmol/L+三氧化二砷1.6μmol/L濃度下BCL2/BAX比值為0.2629±0.0050，地西他濱8μmol/L聯(lián)合三氧化二砷3.2μmol/L濃度下BCL2/BAX比值為0.1160±0.0154，

15、兩聯(lián)合用藥組比較及聯(lián)合用藥者與單藥組比較都具有顯著差異(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.地西他濱和三氧化二砷對(duì)SKM-1細(xì)胞都具有明顯的抑制作用，且二者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞株具有協(xié)同抑制作用。
　　 2.地西他濱單藥不能使SKM-1細(xì)胞凋亡率明顯增加，但能產(chǎn)生明顯的G2/M期細(xì)胞阻滯;三氧化二砷能明顯誘導(dǎo)SKM-1凋亡;地西他濱聯(lián)合三氧化二砷能夠協(xié)同誘導(dǎo)SKM-1凋亡3.地西他濱和三氧化二砷均能使SKM-1細(xì)胞