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文檔簡介
1、Hippo信號通路在器官發(fā)展過程中主要通過的細胞增殖和凋亡控制器官大小。此信號通路在哺乳動物體內(nèi)高度保守,在人類的癌癥發(fā)生過程中其通路的許多信號分子缺失并促進了癌癥的發(fā)生,暗示其組件具有抑制腫瘤的作用。Yes相關(guān)蛋白(YAP)作為其下游負性調(diào)控最重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子,Hippo信號通路失調(diào),YAP磷酸化減少,活性增加進入細胞核,促進細胞增殖、抑制凋亡的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄增加,從而參與了腫瘤的發(fā)生。
目的:本實驗通過shRNA(sho
2、rthairpinRNA)抑制YAP基因的表達,并觀察其對肝癌細胞SMMC-7721的增殖、凋亡、周期及遷移能力的影響。
方法:以人YAPmRNA編碼區(qū)中的四條序列作為RNA干擾靶點,分別構(gòu)建四個真核表達載體質(zhì)粒shRNA-YAP-1、shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-3、shRNA-YAP-4,用陽離子聚合物瞬時轉(zhuǎn)染法,在293T細胞中篩出兩組干擾效果較好的質(zhì)粒,將它們分別瞬時轉(zhuǎn)染肝癌細胞SMMC-7721。運用實
3、時熒光定量PCR和Westernblot法檢測YAPmRNA和蛋白表達水平的變化;MTT法檢測細胞增殖情況,并繪制細胞生長曲線;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期的改變;細胞劃痕實驗觀察細胞遷移能力。
結(jié)果:運用實時熒光定量PCR和Westernblot法檢測到肝癌細胞SMMC-7721中YAP的mRNA和蛋白表達水平較未轉(zhuǎn)染組均降低。MTT實驗和細胞劃痕模型顯示,shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-4兩組細胞生長明顯抑
4、制,細胞遷移減慢;流式細胞術(shù)顯示,轉(zhuǎn)染48h后,shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-4轉(zhuǎn)染組SMMC-7721細胞凋亡數(shù)(12.01%±0.81、5.03%±1.01,P<0.05)明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(2.89%±0.08),并且細胞被阻滯在G2期,G0/G1期出現(xiàn)DNA亞二倍體峰。
結(jié)論:本實驗運用shRNA干擾技術(shù),可以有效的干擾肝癌SMMC-7721細胞YAPmRNA表達并能降低YAP的生成,抑制SMMC-77
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