shrna沉默人肝癌細(xì)胞株skhep1kir6.2基因的研究

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文shRNA沉默人肝癌細(xì)胞株SK-Hep1 Kir6.2基因的研究姓名：蘇曉通申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)（普外）指導(dǎo)教師：梁平20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文B 1 0 t 檢測磁r 6 ．2 蛋白的相對量。3 ．K 岍通道電流的變化采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法記錄各組細(xì)胞K A T P 通道電流。高阻封接后，首先用細(xì)胞外液進(jìn)行灌流，再用1 0 加m 0 1 ／l 2 一脫氧．D ．葡萄糖( 2 ．d e

2、o x y—D —9 1 u c o s e ，D O G ) 灌流液灌流1 0 分鐘，測量各組的電流，最后換成1 0 0 u M 格列本脲( 9 1 y b e n c l i m a d e ，G l y ) 灌流液灌流1 0 分鐘，再次測量電流，兩次電流相減即可得格列本脲敏感的K | m 電流。采用斜坡電壓刺激，得到各組的I ．V 曲線。。4 ．s Ⅺ斟A 沉默S K ．H 印1 細(xì)胞Ⅺr 6 ．2 基因后對于細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

3、 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期。熒光探針F 1 u 0 4 ．√蝴孵育各組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。M T T 法檢測各組細(xì)胞增殖情況，T r a n s w e n 小室法檢測各組細(xì)胞體外侵襲能力。結(jié)果：1 ．酶切和測序鑒定顯示s h R N A 構(gòu)建成功。2 ．轉(zhuǎn)染、篩選、單克隆擴(kuò)增 R T - P C R 結(jié)果顯示S K ．K 1 組、S K ．K 2 組飚r 6 ．2 枷獻(xiàn)A的表達(dá)與S K 組、S

4、 K ．H K 組比較均明顯降低。S K 組、S K ．腿組豇r 6 ．2 蛋白的量與S K - K 1組、S K - K 2 組比較均明顯增多。3 ．K A T P 通道電流的記錄S K 組、S K ．腿組、S K - K l 組、S K ．懟組的K A 胛電流的分別為( n = 7 ) ( n A ) 1 ．8 0 士O ．6 7 3 ，1 ．8 7 士O ．5 4 1 ，5 ．1 6 士1 ．0 1 1 ，3 ．8 9 士1 ．2

5、 8 7 。S K - K 1 組、S K ．K 2組與S K 組、S K - 瞰組比較電流明顯增強(qiáng)( p < 0 ．0 1 ) ，S K ．K 1 組與S K - 懟組比較電流明顯增強(qiáng)( p < O ．0 5 ) 。4 ．細(xì)胞生物學(xué)特性的變化 S K 組、S K ．H K 組與S K ．K 1 、S K - K 2 組細(xì)胞周期相比，G 0 ．G 1 期細(xì)胞明顯增加( p < O ．0 5 ) ，S 期細(xì)胞減少顯著(

6、p < 0 ．0 5 ) 。S K ．K 1 和S K ．磁組熒光強(qiáng)度明顯弱于S K 組( p < 0 ．0 5 ) ，S K ．K 1 和S k K 2 組鈣離子濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于S K 組( 口< 0 ．0 5 ) 。T r a l l s w e l l 小室法顯示S K 組、S K ．H K 組、S K ．K 1 組、S K ．K 2 組細(xì)胞的增殖分?jǐn)?shù)分別為O ．7 5 2 3 士O ．0 6 8 1 ，0 ．7 3

7、 5 l 士O ．0 5 8 9 ，O ．2 4 9 4 士O ．0 4 8 5 ，O ．2 2 6 1 士0 ．0 2 9 8 。S K ．K 1 組、S K - K 2 組與S K 組比較增殖分?jǐn)?shù)明顯降低( p < O ．0 5 ) 。T r a n s w e U 小室法結(jié)果顯示S K - K 1組、S K ．K 2 組、S K ．H K 組細(xì)胞的穿膜數(shù)分別為4 7 ．o 士7 ．1 ，4 0 ．7 士8 ．O ，1 4 ．

8、3 士5 ．1 ，1 5 ．o 士3 ．7 。S K ．K 1 組、S K ．K 2 組與S K 組比較穿膜細(xì)胞明顯減少( p < O ．0 5 ) ，S K ．H K 組穿膜細(xì)胞明顯多于K 1 組和K 2 組( p < O ．0 5 ) 。結(jié)論：R T ．P C R 、W e s t e m B l o t 證實(shí)s h R N A 沉默了S K - H e p lK i r 6 ．2 基因。膜片鉗實(shí)驗(yàn)證明了干擾后K A T