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1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文shRNA沉默人肝癌細(xì)胞株SK-Hep1 Kir6.2基因的研究姓名:蘇曉通申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:博士專業(yè):外科學(xué)(普外)指導(dǎo)教師:梁平20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文B 1 0 t 檢測(cè)磁r 6 .2 蛋白的相對(duì)量。3 .K 岍通道電流的變化采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法記錄各組細(xì)胞K A T P 通道電流。高阻封接后,首先用細(xì)胞外液進(jìn)行灌流,再用1 0 加m 0 1 /l 2 一脫氧.D .葡萄糖( 2 .d e
2、o x y—D —9 1 u c o s e ,D O G ) 灌流液灌流1 0 分鐘,測(cè)量各組的電流,最后換成1 0 0 u M 格列本脲( 9 1 y b e n c l i m a d e ,G l y ) 灌流液灌流1 0 分鐘,再次測(cè)量電流,兩次電流相減即可得格列本脲敏感的K | m 電流。采用斜坡電壓刺激,得到各組的I .V 曲線。。4 .s Ⅺ斟A 沉默S K .H 印1 細(xì)胞Ⅺr 6 .2 基因后對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
3、 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期。熒光探針F 1 u 0 4 .√蝴孵育各組細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。M T T 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況,T r a n s w e n 小室法檢測(cè)各組細(xì)胞體外侵襲能力。結(jié)果:1 .酶切和測(cè)序鑒定顯示s h R N A 構(gòu)建成功。2 .轉(zhuǎn)染、篩選、單克隆擴(kuò)增 R T - P C R 結(jié)果顯示S K .K 1 組、S K .K 2 組飚r 6 .2 枷獻(xiàn)A的表達(dá)與S K 組、S
4、 K .H K 組比較均明顯降低。S K 組、S K .腿組豇r 6 .2 蛋白的量與S K - K 1組、S K - K 2 組比較均明顯增多。3 .K A T P 通道電流的記錄S K 組、S K .腿組、S K - K l 組、S K .懟組的K A 胛電流的分別為( n = 7 ) ( n A ) 1 .8 0 士O .6 7 3 ,1 .8 7 士O .5 4 1 ,5 .1 6 士1 .0 1 1 ,3 .8 9 士1 .2
5、 8 7 。S K - K 1 組、S K .K 2組與S K 組、S K - 瞰組比較電流明顯增強(qiáng)( p < 0 .0 1 ) ,S K .K 1 組與S K - 懟組比較電流明顯增強(qiáng)( p < O .0 5 ) 。4 .細(xì)胞生物學(xué)特性的變化 S K 組、S K .H K 組與S K .K 1 、S K - K 2 組細(xì)胞周期相比,G 0 .G 1 期細(xì)胞明顯增加( p < O .0 5 ) ,S 期細(xì)胞減少顯著(
6、p < 0 .0 5 ) 。S K .K 1 和S K .磁組熒光強(qiáng)度明顯弱于S K 組( p < 0 .0 5 ) ,S K .K 1 和S k K 2 組鈣離子濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于S K 組( 口< 0 .0 5 ) 。T r a l l s w e l l 小室法顯示S K 組、S K .H K 組、S K .K 1 組、S K .K 2 組細(xì)胞的增殖分?jǐn)?shù)分別為O .7 5 2 3 士O .0 6 8 1 ,0 .7 3
7、 5 l 士O .0 5 8 9 ,O .2 4 9 4 士O .0 4 8 5 ,O .2 2 6 1 士0 .0 2 9 8 。S K .K 1 組、S K - K 2 組與S K 組比較增殖分?jǐn)?shù)明顯降低( p < O .0 5 ) 。T r a n s w e U 小室法結(jié)果顯示S K - K 1組、S K .K 2 組、S K .H K 組細(xì)胞的穿膜數(shù)分別為4 7 .o 士7 .1 ,4 0 .7 士8 .O ,1 4 .
8、3 士5 .1 ,1 5 .o 士3 .7 。S K .K 1 組、S K .K 2 組與S K 組比較穿膜細(xì)胞明顯減少( p < O .0 5 ) ,S K .H K 組穿膜細(xì)胞明顯多于K 1 組和K 2 組( p < O .0 5 ) 。結(jié)論:R T .P C R 、W e s t e m B l o t 證實(shí)s h R N A 沉默了S K - H e p lK i r 6 .2 基因。膜片鉗實(shí)驗(yàn)證明了干擾后K A T
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