增強型綠色熒光蛋白基因轉染兔間充質(zhì)干細胞的實驗研究.pdf

1、目的：應用G-CSF動員骨髓干細胞后分離外周血間充質(zhì)干細胞(MSCs)，并體外培養(yǎng)擴增，經(jīng)鑒定后用重組腺病毒(攜帶增強型綠色熒光蛋白基因)轉染，建立表達增強型綠色熒光蛋白的間充質(zhì)干細胞系。 方法：應用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)兔外周血MSCs，并用顯微鏡觀察細胞形態(tài)，測定原代及傳代細胞的生長曲線；MSCs經(jīng)液氮凍存半年復蘇，觀察細胞凍存前后的生長狀況，并用臺盼藍法測定其存活率；取培養(yǎng)第3代MSCs以CD34、CD45和

2、CD44的表達作流式細胞儀鑒定；以表達EGFP的腺病毒載體(Ad-CMV-EGFP)轉染MSCs，熒光倒置顯微鏡下觀察其瞬時表達及轉染效率。 結果： ①MSCs于體外培養(yǎng)2小時開始貼壁生長，9～12天可見有集落形成，14～20天可達到80％～90％融合，倒置相差顯微鏡見細胞形態(tài)為梭形、多角形及紡錘狀等。傳代MSCs變?yōu)樾螒B(tài)均一、排列有序的長梭形細胞，增殖活躍； ②MSCs生長曲線呈“s”型，傳代細胞平均倍增時間為

3、30h； ③MSCs經(jīng)6個月凍存后復蘇培養(yǎng)，細胞形態(tài)及生長狀況與凍存前無明顯差別，均呈長梭形，細胞生長增殖旺盛； ④流式細胞儀檢測MSCs表面抗原CD34、CD45呈陰性表達，CD44呈陽性表達； ⑤MSCs經(jīng)腺病毒轉染后24h即可表達EGFP，5d表達最強，此后逐漸減弱，到4周時仍可見少量表達； ⑥測定腺病毒轉染MSCs效率約為60％。 結論： ①采用密度梯度離心法和貼壁法可以有效獲得應