轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的大鼠胚胎肝干細胞的鑒定及治療急性肝損傷的實驗研究.pdf

1、終末期肝病包括晚期肝癌以及很多肝臟代謝性疾病目前尚無理想治療方法，肝移植被認(rèn)為是最有效的治療手段，但同時也存在很多問題，比如肝源不足、手術(shù)創(chuàng)傷大、排斥反應(yīng)等。隨著肝干細胞研究的不斷深入，近年來國內(nèi)外報道了很多肝干細胞的分離的成功經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)了大量肝干細胞表面標(biāo)志，并采用了多種實驗技術(shù)對肝干細胞進行標(biāo)記和示蹤，以便能對其分化和體內(nèi)移植后的遷移分化進行示蹤研究，其中利用熒光蛋白基因修飾肝干細胞的技術(shù)已經(jīng)比較成熟并得到公認(rèn)。利用肝干細胞作為種子

2、細胞移植到受體體內(nèi)治療相關(guān)肝臟疾病的研究也越來越多。與肝移植比較，肝干細胞移植具有操作簡單、創(chuàng)傷小、可重復(fù)進行、一肝多用等優(yōu)點，因此肝干細胞和肝干細胞移植的研究越來越成為熱點并取得了一定的研究進展。本實驗室從孕14d大鼠胚肝中分離出大鼠肝干細胞，并用pAcGFP1-N1轉(zhuǎn)染干細胞使其能表達GFP作為示蹤。在轉(zhuǎn)染pAcGFP1-N1的基礎(chǔ)上，本實驗進一步研究轉(zhuǎn)染熒光蛋白基因?qū)Ω胃杉毎隗w外培養(yǎng)時功能的影響。并建立動物急性肝損傷模型，初步探

3、索干細胞移植對大鼠急性肝損傷的修復(fù)作用。
　　一、轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的大鼠胚胎肝干細胞的鑒定
　　本實驗采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pAcGFP1-N1質(zhì)粒到大鼠胚胎肝干細胞。熒光倒置顯微鏡證實轉(zhuǎn)染成功后，分別按培養(yǎng)時間和消化時間不同挑選肝干細胞，挑選的細胞再次培養(yǎng)至鋪滿瓶底后收集細胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用ELISA方法測定ICAM-1含量。實驗按照接種時間不同和胰酶消化時間不同分組，用流式細胞儀檢測c-Met陽性細胞的比例。鏡下見胚胎干細胞在

4、轉(zhuǎn)染pAcGFP1-N1質(zhì)粒后細胞形態(tài)較轉(zhuǎn)染前無明顯變化，熒光倒置顯微鏡見大量細胞發(fā)出綠色熒光。各組細胞ICAM-1含量和c-Met陽性細胞都隨培養(yǎng)時間延長而減少，隨消化時間延長而增多。實驗證明胚胎肝干細胞在轉(zhuǎn)染熒光蛋白質(zhì)粒pAcGFP1-N1后鏡下細胞形態(tài)無變化，轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)時先貼壁的細胞和消化時后被消化下來的細胞表達更多的細胞粘附分子ICAM-1，并表達更多的肝干細胞表面標(biāo)志c-Met，這種方法有利于分選出純度更高的肝干細胞。<

5、br>　　二、大鼠胚胎肝干細胞移植對大鼠急性肝損傷的修復(fù)作用
　　本實驗用60％四氯化碳色拉油溶液建立大鼠急性肝損傷模型，實驗分為對照組，移植組和正常組。建模成功后移植組大鼠股靜脈注射轉(zhuǎn)染熒光蛋白基因的干細胞。對照組和正常組股靜脈注射生理鹽水。分別于建模開始第1、14、18、30天斷尾取血檢測血清ALT、AST、TBIL。取肝組織觀察移植后肝臟內(nèi)熒光蛋白的表達并做石蠟切片并行HE染色光鏡下觀察。觀察到肝干細胞移植后移植組的各組測量