轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的大鼠胚胎肝干細(xì)胞的鑒定及治療急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、終末期肝病包括晚期肝癌以及很多肝臟代謝性疾病目前尚無理想治療方法，肝移植被認(rèn)為是最有效的治療手段，但同時(shí)也存在很多問題，比如肝源不足、手術(shù)創(chuàng)傷大、排斥反應(yīng)等。隨著肝干細(xì)胞研究的不斷深入，近年來國(guó)內(nèi)外報(bào)道了很多肝干細(xì)胞的分離的成功經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了大量肝干細(xì)胞表面標(biāo)志，并采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)肝干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和示蹤，以便能對(duì)其分化和體內(nèi)移植后的遷移分化進(jìn)行示蹤研究，其中利用熒光蛋白基因修飾肝干細(xì)胞的技術(shù)已經(jīng)比較成熟并得到公認(rèn)。利用肝干細(xì)胞作為種子

2、細(xì)胞移植到受體體內(nèi)治療相關(guān)肝臟疾病的研究也越來越多。與肝移植比較，肝干細(xì)胞移植具有操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、可重復(fù)進(jìn)行、一肝多用等優(yōu)點(diǎn)，因此肝干細(xì)胞和肝干細(xì)胞移植的研究越來越成為熱點(diǎn)并取得了一定的研究進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)室從孕14d大鼠胚肝中分離出大鼠肝干細(xì)胞，并用pAcGFP1-N1轉(zhuǎn)染干細(xì)胞使其能表達(dá)GFP作為示蹤。在轉(zhuǎn)染pAcGFP1-N1的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)染熒光蛋白基因?qū)Ω胃杉?xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)功能的影響。并建立動(dòng)物急性肝損傷模型，初步探

3、索干細(xì)胞移植對(duì)大鼠急性肝損傷的修復(fù)作用。
　　一、轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的大鼠胚胎肝干細(xì)胞的鑒定
　　本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pAcGFP1-N1質(zhì)粒到大鼠胚胎肝干細(xì)胞。熒光倒置顯微鏡證實(shí)轉(zhuǎn)染成功后，分別按培養(yǎng)時(shí)間和消化時(shí)間不同挑選肝干細(xì)胞，挑選的細(xì)胞再次培養(yǎng)至鋪滿瓶底后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用ELISA方法測(cè)定ICAM-1含量。實(shí)驗(yàn)按照接種時(shí)間不同和胰酶消化時(shí)間不同分組，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)c-Met陽(yáng)性細(xì)胞的比例。鏡下見胚胎干細(xì)胞在

4、轉(zhuǎn)染pAcGFP1-N1質(zhì)粒后細(xì)胞形態(tài)較轉(zhuǎn)染前無明顯變化，熒光倒置顯微鏡見大量細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。各組細(xì)胞ICAM-1含量和c-Met陽(yáng)性細(xì)胞都隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而減少，隨消化時(shí)間延長(zhǎng)而增多。實(shí)驗(yàn)證明胚胎肝干細(xì)胞在轉(zhuǎn)染熒光蛋白質(zhì)粒pAcGFP1-N1后鏡下細(xì)胞形態(tài)無變化，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)先貼壁的細(xì)胞和消化時(shí)后被消化下來的細(xì)胞表達(dá)更多的細(xì)胞粘附分子ICAM-1，并表達(dá)更多的肝干細(xì)胞表面標(biāo)志c-Met，這種方法有利于分選出純度更高的肝干細(xì)胞。<

5、br>　　二、大鼠胚胎肝干細(xì)胞移植對(duì)大鼠急性肝損傷的修復(fù)作用
　　本實(shí)驗(yàn)用60％四氯化碳色拉油溶液建立大鼠急性肝損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，移植組和正常組。建模成功后移植組大鼠股靜脈注射轉(zhuǎn)染熒光蛋白基因的干細(xì)胞。對(duì)照組和正常組股靜脈注射生理鹽水。分別于建模開始第1、14、18、30天斷尾取血檢測(cè)血清ALT、AST、TBIL。取肝組織觀察移植后肝臟內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)并做石蠟切片并行HE染色光鏡下觀察。觀察到肝干細(xì)胞移植后移植組的各組測(cè)量