2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、本文以柿單寧為研究對(duì)象,旨在研究柿單寧對(duì)膽固醇體內(nèi)外代謝的分子調(diào)控機(jī)制。我們首先構(gòu)建HepG2以及Caco-2高膽固醇細(xì)胞模型,并結(jié)合real-time RT-PCR以及western-blot技術(shù)探索柿單寧體外調(diào)控膽固醇代謝平衡的分子機(jī)制;隨后,研究柿單寧及膽固醇對(duì)Caco-2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以及膜受體EGFR的影響;并以高膽固醇飼料誘導(dǎo)膽固醇在C57BL/6J小鼠體內(nèi)積累以構(gòu)建高膽固醇小鼠模型,探索柿單寧對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)途徑以及膽

2、固醇經(jīng)腸道直接排出(TICE)途徑的影響;最后借助Caco-2細(xì)胞單層模型,探索柿單寧特征結(jié)構(gòu)單元對(duì)熒光標(biāo)記的膽固醇在該模型中轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的影響。主要研究結(jié)果如下;
  1.柿單寧對(duì)高膽固醇HepG2以及Caco-2細(xì)胞模型中膽固醇積累的影響
  使用20μg/mL膽固醇以及2μg/mL25-羥基膽固醇干預(yù)HepG2以及Caco-2細(xì)胞,構(gòu)建高膽固醇細(xì)胞模型,探索柿單寧在該模型中對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明,經(jīng)高膽固醇誘

3、導(dǎo)液孵育24h后,細(xì)胞總膽固醇(TC)含量以及培養(yǎng)液中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度明顯高于正常組(p<0.05),60μg/mL柿單寧干預(yù)之后,兩種細(xì)胞系中TC含量明顯下降20%、26%;LDL-C及載脂蛋白B(ApoB)的水平顯著降低(p<0.05)而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度顯著升高(p<0.05);此外,柿單寧抑制22-NBD-膽固醇在細(xì)胞內(nèi)的積累。Real-time RT-PCR以及western-blot實(shí)驗(yàn)

4、結(jié)果表明,柿單寧下調(diào)與膽固醇吸收相關(guān)基因——尼曼-匹克C1型類似蛋白1(NPC1L1)以及與膽固醇合成相關(guān)基因——固醇調(diào)控調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP-2)的表達(dá)(p<0.05);顯著上調(diào)與膽固醇外流相關(guān)基因的表達(dá)(p<0.05),如膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G5和G8(ABCG5/G8)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1(ABCG1)以及低密度脂蛋白受體(LDLR);在翻譯

5、水平上,柿單寧對(duì)CYP7A1與ABCA1的蛋白水平的調(diào)控與其對(duì)mRNA的調(diào)控一致。此外,我們利用小干擾RNA(siRNA)沉默LXRα基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其并未影響柿單寧對(duì)ABCA1以及CYP7A1基因及蛋白的上調(diào)作用。因此,柿單寧抑制細(xì)胞膽固醇的積累并不依賴于LXRα的激活。
  2.柿單寧對(duì)Caco-2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以及膜受體蛋白EGFR的影響
  在Caco-2細(xì)胞中,2.5mM甲基化-β-環(huán)糊精(MCD)的干預(yù)明顯造成Cac

6、o-2細(xì)胞膜膽固醇的貧化,使細(xì)胞總膽固醇含量降低94.1%(p<0.05);FilipinⅢ染色則進(jìn)一步佐證MCD對(duì)細(xì)胞膜膽固醇的提取作用。利用熒光探針(Laurdan/DPH/TMA-DPH)偏振度的變化來分析柿單寧對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響。結(jié)果表明,細(xì)胞膜膽固醇的貧化造成熒光探針偏振度降低,即細(xì)胞膜流動(dòng)性增加;柿單寧干預(yù)則抑制MCD對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的促進(jìn)作用。另外,通過FilipinⅢ以及異硫氰酸熒光素標(biāo)記的霍亂毒素B亞基(CTB-FIT

7、C)分別染色細(xì)胞膜膽固醇以及細(xì)胞膜脂質(zhì)筏后,發(fā)現(xiàn)柿單寧可保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)免受脫氧膽酸(DCA)、Triton X-100以及MCD的破壞。在轉(zhuǎn)錄以及翻譯水平上,MCD明顯上調(diào)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)以及胞外信號(hào)調(diào)控激酶1和2(ERK1/2)的基因表達(dá)和蛋白磷酸化程度,柿單寧則明顯減弱由MCD誘導(dǎo)的EGFR以及ERK1/2基因和蛋白的上調(diào)作用(p<0.05);柿單寧逆轉(zhuǎn)由外源性膽固醇干預(yù)對(duì)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)在mRN

8、A以及蛋白表達(dá)上的下調(diào)作用以及MCD對(duì)PPARγ的上調(diào)作用,使PPARγ的表達(dá)趨于正常。因此,我們推測(cè)柿單寧可能通過對(duì)細(xì)胞膜受體蛋白EGFR以及ERK1/2-PPARγ信號(hào)通路的調(diào)控,影響Caco-2細(xì)胞信號(hào)傳遞以及細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)等生理功能。
  3.柿單寧高膽固醇膳食誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞-RCT及TICE途徑的影響
  在J774A.1巨噬細(xì)胞中,以1%BSA、25μg/mL乙?;兔芏戎鞍?Ac-LDL)以及20μg/mL

9、膽固醇或4μM22-NBD-膽固醇誘導(dǎo)J774A.1巨噬細(xì)胞分化為荷脂模型,利用油紅O染色細(xì)胞脂質(zhì),并借助western-blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞中ERK1/2以及PPARγ的蛋白水平。結(jié)果表明,柿單寧通過抑制ERK1/2的磷酸化逆轉(zhuǎn)高膽固醇誘導(dǎo)環(huán)境對(duì)pPARγ蛋白水平的下調(diào)作用,從而減少脂滴形成并顯著促進(jìn)22-NBD-膽固醇的細(xì)胞外流(p<0.05)。此外,采用高膽固醇飼料飼喂C57BL/6J小鼠7周,肝組織切片經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn),高膽固醇

10、膳食誘導(dǎo)造成炎性細(xì)胞浸潤(rùn),膳食中添加柿單寧可改善炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。另外,柿單寧顯著降低小鼠血清和肝臟組織中總甘油三酯(TG)、TC和LDL-C,升高HDL-C含量。將22-NBD-膽固醇標(biāo)記的巨噬細(xì)胞腹腔注射入高膽固醇膳食誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠體內(nèi)24h之后,發(fā)現(xiàn)柿單寧可以降低22-NBD-膽固醇在肝臟以及血液內(nèi)積累,并增加22-NBD-膽固醇的糞便排出率;在基因水平上,與高膽固醇組相比,高劑量的柿單寧明顯增加與膽固醇外流相關(guān)基因(

11、ABCA1、LCAT、ABCG5/G8和CYP7A1)以及其上游核受體(PPARγ、PPARα和LXRα)的表達(dá)(p<0.05)。體內(nèi)外數(shù)據(jù)表明,柿單寧對(duì)RCT相關(guān)基因的調(diào)控可能與其對(duì)ERK1/2磷酸化的抑制作用有關(guān)。但是,柿單寧對(duì)C57BL/6J小鼠TICE途徑的影響甚微。因此,柿單寧主要通過對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的調(diào)控從而影響機(jī)體膽固醇穩(wěn)態(tài)。
  4.柿單寧特征結(jié)構(gòu)單元在Caco-2細(xì)胞單層模型中對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的影響
  

12、建立Caco-2細(xì)胞單層模型,通過測(cè)定TEER值、Lucifer Yellow CH的表觀滲透率(Papp)、堿性磷酸酶活性以及觀察細(xì)胞單層模型的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究柿單寧特征結(jié)構(gòu)單元(A型連接ECG以及EGCG二聚體)、A型連接EC二聚體與其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)單體(ECG、EGCG、EC)在Caco-2細(xì)胞單層模型中對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)攝取的影響,并探索柿單寧結(jié)構(gòu)單元的轉(zhuǎn)運(yùn)特征對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的影響。結(jié)果表明,柿單寧特征結(jié)構(gòu)單元與其余四種被檢物質(zhì)通

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