LncRNA--ncRuPAR對胃癌的調(diào)控機制及滋陰化痰方的干預作用.pdf

1、研究目的:課題組前期發(fā)現(xiàn)lncRNA-ncRuPAR在胃癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織，且與胃癌的浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤的大小及TNM分期密切相關，臨床有效方藥“滋陰化痰方”可抑制胃癌細胞增殖。本課題旨在通過一系列體內(nèi)外實驗探究ncRuPAR與胃癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡的關系及其可能的作用機制，并驗證“滋陰化痰方”是否通過干預ncRuPAR發(fā)揮其對胃癌的治療作用，以期深化對胃癌發(fā)病分子機制的認識，并為闡釋滋陰化痰方可能

2、的作用機制提供數(shù)據(jù)支持。
　　研究方法:(1)通過實時熒光定量PCR(Quantitative Real Time PCR，qPCR)技術(shù)檢測AGS，HGC27，MKN45，MGC8034株胃癌細胞中ncRuPAR的表達水平。(2)重組慢病毒LV-NCRUPAR(15034-1)和LV-NCRUPAR-CON分別感染HGC27細胞，構(gòu)建HGC27過表達細胞株HGC27-ncRuPAR及對照細胞株HGC27-Empty Vector

3、;重組慢病毒LV-NCRUPAR-RNAi和LV-NCRUPAR-RNAi-CON分別感染MGC803細胞構(gòu)建MGC803干擾細胞株MGC803-ncRuPAR-RNAi及對照細胞株MGC803-Empty Vector，嘌呤霉素2μg/mL篩選72h后形成慢病毒感染表達穩(wěn)定株，qPCR檢測各穩(wěn)株中ncRuPAR的表達量。(3)CCK-8法檢測ncRuPAR對胃癌細胞HGC27和MGC803增殖的影響;流式細胞計數(shù)儀分析ncRuPAR對

4、胃癌細胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影響;細胞劃痕實驗觀察ncRuPAR對胃癌細胞HGC27和MGC803遷移能力的影響;Transwell實驗觀察ncRuPAR對胃癌細胞HGC27和MGC803侵襲能力的影響。(4)將HGC27-ncRuPAR，HGC27-Empty Vector及HGC27-Control細胞株分別在裸鼠皮下接種造HGC27皮下移植瘤模型，觀察各組裸鼠一般情況及比較瘤體體積和質(zhì)量，比較ncRuPAR對HGC

5、27皮下移植瘤裸鼠腫瘤生長的影響。(5)Affymetrix基因表達譜芯片技術(shù)篩選HGC27-ncRuPAR細胞株和HGC27-Empty Vector細胞株之間差異表達基因，并將芯片分析的差異基因結(jié)果進行IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis，IPA)分析，推測ncRuPAR影響胃癌細胞增殖凋亡的可能通路;Western blot實驗檢測ncRuPAR對HGC27和MGC803細胞中PAR-1蛋白及PI3K/Ak

6、t信號通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表達的影響。(6)中藥“滋陰化痰方”干預HGC27和MGC803細胞株，CCK-8法檢測細胞增殖變化，觀察滋陰化痰方對胃癌細胞增殖的影響;流式細胞計數(shù)儀分析滋陰化痰方對胃癌細胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影響;qPCR檢測滋陰化痰方對胃癌細胞ncRuPAR表達的影響，觀察滋陰化痰方是否對ncRuPAR的表達存在調(diào)控作用;Western blot驗證滋陰化痰方對PAR-1蛋白及PI

7、3K/Akt信號通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表達的影響，探究滋陰化痰方可能的作用機制。
　　研究結(jié)果:(1)qPCR結(jié)果顯示:ncRuPAR在HGC27細胞中低表達，在MGC803細胞中高表達。(2)選擇HGC27細胞構(gòu)建ncRuPAR過表達穩(wěn)定株，選用MGC803細胞構(gòu)建ncRuPAR干擾穩(wěn)定株，qPCR驗證ncRuPAR過表達及干擾穩(wěn)株構(gòu)建成功。(3)CCK-8和流式細胞周期結(jié)果顯示:過表達ncRuPAR可抑制

8、HGC27細胞的增殖，使細胞周期阻滯于G1期，并促進其凋亡，而干擾ncRuPAR表達則抑制MGC803細胞增殖、減少細胞凋亡。劃痕實驗和transwells實驗結(jié)果顯示:ncRuPAR對胃癌細胞HGC27和MGC803的遷移及侵襲能力影響不顯著。(4)體內(nèi)實驗中，HGC27-ncRuPAR組與對照組相比，實驗組裸鼠成瘤減慢，瘤體減小。(5)Western blot結(jié)果顯示:過表達ncRuPAR使HGC27細胞中PAR-1、PI3K、p-

9、Akt、CyclinD1蛋白的表達下降;而干擾ncRuPAR則可使MGC803細胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表達升高。(6)中藥“滋陰化痰方”作用于胃癌HGC27和MGC803細胞，CCK-8和流式細胞周期結(jié)果顯示:中藥“滋陰化痰方”可以抑制細胞增殖，阻滯細胞周期并誘導細胞凋亡;qPCR結(jié)果顯示滋陰化痰方可以增加胃癌細胞中ncRuPAR的表達;Western blot結(jié)果顯示滋陰化痰方可以抑制PI3K、p