siRNA作用于Vimentin抑制大鼠脊髓傷后膠質(zhì)瘢痕形成的研究.pdf

1、【目的】
　　設(shè)計(jì)篩選siRNA干擾中間絲波形蛋白（Vimentin）序列，觀察siRNA-Vimentin對(duì)脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）和硫酸軟骨素蛋白多糖（Chondroitin Sulfate Proteoglycans，CSPG）表達(dá)的影響，分析其對(duì)脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)電生理功能恢復(fù)的作用，及其對(duì)脊髓組織GFAP、CSPG

2、和Vimentin的表達(dá)及膠質(zhì)瘢痕形成的影響。探討siRNA作用于Vimentin在脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和膠質(zhì)瘢痕形成過(guò)程中所起的作用。
　　【方法】
　　設(shè)計(jì)3條Vimentin干擾序列，并利用Western Blot及RT-PCR篩選出沉默效果相對(duì)較好的序列；初生SD乳鼠分離培養(yǎng)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞，并經(jīng)差速貼壁等方法純化，GFAP免疫化學(xué)熒光鑒定獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞。將細(xì)胞分為正常培養(yǎng)AS組、空載質(zhì)粒處理陰性對(duì)照組

3、和siRNA-Vimentin轉(zhuǎn)染組，進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、MTT法測(cè)定各組細(xì)胞增殖能力，免疫熒光化學(xué)染色及RT-PCR驗(yàn)證siRNA作用于Vimentin對(duì)脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕形成的影響及GFAP、CSPG和Vimentin之間的相互作用。同時(shí)，采用改良Allen垂直打擊法制備SD大鼠脊髓胸10（T10）脊髓損傷動(dòng)物模型，并將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組（30只）、陰性對(duì)照組（30只）和siRNA-Vimentin

4、組（30只），于造模同時(shí)假手術(shù)組注射DMEM/F12培養(yǎng)基5μl，陰性對(duì)照組注射DMEM/F12培養(yǎng)基+空載質(zhì)粒5μl，siRNA-Vimentin組注射DMEM/F12培養(yǎng)基+siRNA-Vimentin質(zhì)粒5μl。分別于術(shù)后24h、1w、2w、4w、8w和12w進(jìn)行BBB評(píng)分，并于術(shù)后24h和12w進(jìn)行SEP、MEP測(cè)定；術(shù)后4w取各組脊髓組織進(jìn)行RT-PCR測(cè)定GFAP、CSPGs和Vimentin表達(dá)情況；術(shù)后12w取各組脊髓組

5、織計(jì)算各組膠質(zhì)瘢痕體積。收集以上各數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　【結(jié)果】
　　設(shè)計(jì)篩選的3條siRNA干擾序列中，siRNA-Vimentin-1073相對(duì)沉默效果最好，轉(zhuǎn)染效率最高為轉(zhuǎn)染后24h，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率＞80％；原代分離培養(yǎng)的SD大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞純化后，經(jīng)GFAP胞漿免疫熒光染色及DAPI細(xì)胞核染色，隨機(jī)選取6個(gè)視野觀察，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞百分比約為（96.14±1.03）%；星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，siRNA-Vimi

6、ntin組2d/0d寬度比為（0.74±0.17），數(shù)值明顯為高（P<0.05），與MTT結(jié)果共同提示siRNA作用于Vimintin對(duì)反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生有抑制作用；各組細(xì)胞免疫熒光染色積分光密度（IOD）和Western Blot檢測(cè)siRNA-Vimintin轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞后GFAP、CSPG及Vimentin的表達(dá)同時(shí)下調(diào)，與正常培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞組和空載質(zhì)粒陰性對(duì)照比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；術(shù)后8w、12w siR

7、NA-Vimentin組BBB評(píng)分提高較為明顯（P<0.05）；術(shù)后12w，siRNA-Vimentin組 SEP、MEP與其他各組比較改善較為明顯（P<0.05）；術(shù)后12w，損傷早期局部注射siRNA-Vimentin的脊髓損傷大鼠模型組，膠質(zhì)瘢痕體積較對(duì)照組明顯較?。≒<0.05）。術(shù)后4w各組RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-Vimentin組脊髓組織中GFAP、CSPG和Vimentin表達(dá)均顯著下調(diào)。
　　【結(jié)論】