桃紅四物湯降低腦缺血-再灌注損傷及信號(hào)通路研究.pdf

1、背景:桃紅四物湯為活血化瘀經(jīng)典方劑，臨床上廣泛用于心腦血管疾病的治療，但其作用的分子機(jī)制仍不明確。本研究擬在證實(shí)桃紅四物湯對(duì)腦缺血損傷保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)與分子藥理學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法闡明其作用的分子機(jī)制。本課題獲得了重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(2012-2-87)的支持。
　　目的:驗(yàn)證桃紅四物湯對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用，尋找潛在蛋白靶標(biāo)，表征關(guān)鍵的蛋白信號(hào)通路，闡明其作用的關(guān)鍵分子機(jī)制。為活血化瘀經(jīng)典方的作用機(jī)制的深入闡

2、釋提供參考，并為其用于腦缺血的臨床防治提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、桃紅四物湯對(duì)腦缺血損傷保護(hù)作用的驗(yàn)證。在大鼠暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈阻塞(tMCAO)模型上，測定神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗塞體積，以考察桃紅四物湯對(duì)tMACO大鼠腦損傷的保護(hù)作用。采用氧糖剝奪-復(fù)氧(OGD-Reoxy)體外細(xì)胞模型，同時(shí)以CCK-8檢測細(xì)胞存活率，以考察桃紅四物湯對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。
　　2、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定桃紅

3、四物湯潛在的靶標(biāo)蛋白。差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析桃紅四物湯作用的蛋白靶標(biāo)采用二維凝膠電泳分離桃紅四物湯作用前后的PC12細(xì)胞蛋白，通過生物質(zhì)譜鑒定差異表達(dá)蛋白;qPCR在mRNA水平驗(yàn)證關(guān)鍵的靶標(biāo)蛋白對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析，選擇關(guān)鍵的差異蛋白在mRNA水平進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證;分析桃紅四物湯中各單味藥對(duì)代表性關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)作用針對(duì)代表性蛋白，采用免疫印跡法檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)，以相同濃度(0.5mg·mL-1)單味中藥（桃仁、紅花、生地、當(dāng)歸、川芎

4、、赤芍）提取物給藥處理24小時(shí)，分析單味藥的誘導(dǎo)活性。采用撤藥分析法，即依次從此復(fù)方中撤去一味中藥以相同濃度(1 mg·mL-1)提取物給藥處理24小時(shí)。再測定剩余藥味組成處方對(duì)HO-1的誘導(dǎo)作用，分析方中各藥味對(duì)整個(gè)復(fù)方誘導(dǎo)關(guān)鍵蛋白表達(dá)影響。
　　3、關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白通路在桃紅四物湯對(duì)氧糖剝奪-復(fù)氧損傷保護(hù)中的作用研究。在PC12細(xì)胞上，首先通過免疫蛋白印跡法研究桃紅四物湯對(duì)關(guān)鍵Ⅱ相蛋白酶HO-1表達(dá)的影響;再通過免疫蛋白印跡法與免

5、疫細(xì)胞熒光染色法對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2核轉(zhuǎn)移進(jìn)行研究，同時(shí)還采用免疫蛋白印跡法及相應(yīng)的抑制劑對(duì)Nrf2上游的蛋白激酶的作用進(jìn)行研究，以表征桃紅四物湯對(duì)Nrf2信號(hào)通路的作用;最后，通過采用PI3K特異性抑制劑抑制PI3K/Akt活性與采用誘騙寡核苷酸技術(shù)阻斷Nrf2的調(diào)控作用，在體外細(xì)胞模型上，以確證PI3K/Akt與Nrf2信號(hào)通路對(duì)桃紅四物湯保護(hù)作用的影響。
　　結(jié)果:
　　1、桃紅四物湯對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用的研究。與假手

6、術(shù)組相比，tMCAO損傷模型組動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分均值顯著降低，顯示造模成功。與模型組相比，桃紅四物湯提取物0.5 g·kg-1·day-1、1 g·kg-1·day-1、1.5g·kg-1·day-1組動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高。提示桃紅四物湯提取物對(duì)缺血再灌注引起的大鼠腦損傷具有保護(hù)作用。其中桃紅四物湯1.0g·kg-1·day-1組效果最優(yōu)。
　　與假手術(shù)組相比，tMCAO損傷模型組大鼠出現(xiàn)顯著腦梗死體積，顯示造模成功。與模型組相

7、比，桃紅四物湯提取物0.5 g·kg-1·day-1、1 g·kg-1·day-1、1.5g·kg-1·day-1組大鼠腦梗死體積顯著降低。提示桃紅四物湯提取物可減輕缺血-再灌注引起的腦損傷。其中桃紅四物湯中劑量組1.0g·kg-1·day-1組效果最優(yōu)。提示桃紅四物湯可顯著減輕tMCAO模型動(dòng)物腦缺血損傷。
　　與正常對(duì)照組相比，0-2 mg·mL-1桃紅四物湯對(duì)PC12細(xì)胞處理24 h均不具有細(xì)胞毒性，提示可用于后續(xù)的保護(hù)作用

8、研究。與正常對(duì)照組相比，OGD-Reoxy模型組細(xì)胞活性顯著降低，顯示損傷造模成功。與模型組相比，桃紅四物湯0.5mg·mL-1、1 mg·mL-1、1.5mg·mL-1組細(xì)胞存活率均顯著升高。提示桃紅四物湯提取物對(duì)PC12細(xì)胞OGD-Reoxy損傷具有保護(hù)作用。
　　2、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定桃紅四物湯潛在的靶標(biāo)蛋白。差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析桃紅四物湯作用的蛋白靶標(biāo)共26個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)被成功鑒定。Gene Ontology(GO)分

9、析顯示這些蛋白參與多種生物過程具有不同分子功能。
　　Nrf2介導(dǎo)的Ⅱ相抗氧化酶為桃紅四物湯的主要靶標(biāo)蛋白在26個(gè)被鑒定的蛋白中有6個(gè)屬于轉(zhuǎn)錄因子Nrf2介導(dǎo)的Ⅱ相蛋白酶。實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證顯示0.5mg·mL-1、1 mg·mL-1、1.5mg·mL-1不同濃度桃紅四物湯在轉(zhuǎn)錄水平可誘導(dǎo)改變這些基因的表達(dá)。
　　桃紅四物湯單昧藥之間存在對(duì)HO-1的協(xié)同誘導(dǎo)效應(yīng)。單味藥提取物的試驗(yàn)結(jié)果顯示，川芎或赤芍對(duì)HO-1具有非常強(qiáng)的誘

10、導(dǎo)作用。紅花也顯著誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。當(dāng)歸具較弱的HO-1誘導(dǎo)作用，而其它組分沒有表現(xiàn)出可檢測的誘導(dǎo)HO-1表達(dá)作用。
　　撤藥分析法試驗(yàn)結(jié)果顯示，桃紅四物湯全方顯著誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。撤去川芎或當(dāng)歸后HO-1表達(dá)極顯著下降。撤去紅花或赤芍后HO-1表達(dá)也顯著降低。桃仁或生地單味藥實(shí)驗(yàn)對(duì)HO-1沒有顯著誘導(dǎo)作用，而當(dāng)分別從全方中撤去此兩味藥后，HO-1表達(dá)亦有所降低。四物湯與桃紅四物湯比較，表現(xiàn)出較弱的HO-1誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果表明

11、，桃紅四物湯中川芎、當(dāng)歸、紅花和赤芍是主要誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的活性成分。然而，整個(gè)復(fù)方誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的能力包含所有單味中藥的作用，處方藥味間可能存在協(xié)同效應(yīng)。
　　3、桃紅四物湯對(duì)腦缺血損傷保護(hù)的關(guān)鍵分子機(jī)制驗(yàn)證研究。在體外細(xì)胞模型上，桃紅四物湯能濃度依賴性（0.25 mg·ml-1、0.5 mg·ml-1和1.0mg·ml-1范圍內(nèi)）與時(shí)間依賴性地（0-18h內(nèi)）誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，并可明顯促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)移;0.5 mg·ml-

12、1與1.0 mg·ml-1桃紅四物湯均顯著地提高了PC12細(xì)胞OGD-Reoxy損傷下的存活率。在20μMLY294002預(yù)處理下，1.0 mg·ml-1桃紅四物湯的保護(hù)作用顯著降低，0.5 mg·ml-1桃紅四物湯的保護(hù)作用亦呈現(xiàn)降低趨勢，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ARE誘騙ODNs能抑制Nrf2調(diào)控的Ⅱ相酶表達(dá)。在ARE誘騙ODNs預(yù)處理下，桃紅四物湯(1.0 mg·ml-1)的保護(hù)作用顯著降低，盡管ARE mut ODNs也一定程度上降低

13、了桃紅四物湯的保護(hù)作用，但是降低的程度明顯小于ARE誘騙ODNs的作用。結(jié)果顯示，LY294002與ARE誘騙ODNs顯著降低了桃紅四物湯對(duì)OGD-Reoxy損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)，表明桃紅四物湯的保護(hù)作用可能由PI3K/Akt與Nrf2信號(hào)通路產(chǎn)生。
　　結(jié)論:
　　1.本研究在體內(nèi)動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型上，驗(yàn)證了桃紅四物湯對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用;
　　2.再采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法系統(tǒng)分離與鑒別定出了26個(gè)桃紅四物湯