丙酮酸乙酯對急性肝損傷保護作用的研究.pdf

1、目的：通過研究丙酮酸乙酯對急性肝損傷大鼠腸粘膜緊密連接蛋白ZO-1表達和肝枯否細胞炎癥因子釋放以及對血管內(nèi)皮細胞炎癥因子釋放的影響，探討丙酮酸乙酯對急性肝損傷的保護作用及其機制。 材料與方法：第一部分實驗：Wistar大鼠30只，隨機分為對照組(腹腔注射等量生理鹽水)、急性肝損傷組(D-GalN/LPS 700mg/5ug/kg腹腔注射)、EP預(yù)防組(于D-GalN/LPS注射前1h，EP40mg/kg腹腔注射)。以上各組于注射

2、造模后48h自腹主動脈采血做血漿ALT及內(nèi)毒素水平的檢測，并留取一段腸組織HE染色觀察并采用免疫組化方法測定腸粘膜上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1的表達。第二部分實驗：Wistar大鼠30只，隨機分為對照組(腹腔注射等量生理鹽水)、急性肝損傷組(D-GalN/LPS 700mg/5ug/kg腹腔注射)、EP治療組(于注射D-GaIN/LPS后24h，EP40mg/kg腹腔注射)。各組于注射造模后48h腹主動脈取血，分別用自動生化儀測血漿AL

3、T含量、ELISA方法檢測血漿TNF-α含量、Western blot療法檢測血漿HMGB1含量。第三部分實驗：1、新生兒臍靜脈內(nèi)皮細胞體外原代培養(yǎng)與鑒定：將新生兒臍靜脈通過酶消化法使內(nèi)皮細胞脫落，進行原代培養(yǎng)并采用免疫組化方法對內(nèi)皮細胞vWF因子進行鑒定。2、細胞免疫組化實驗分為三組：對照組、LPS刺激組、EP組，采用免疫組化方法檢測臍靜脈內(nèi)皮細胞HMGB1、ICAM-1的表達；3、HMGB1在人臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌的時間規(guī)律以及丙酮酸

4、乙酯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌HMGB1的作用：細胞分三組，對照組、LPS刺激組(LPS100ng/ml)與EP組(LPS100ng/ml+EP10mM)，每組設(shè)5個復孔，設(shè)0h、6h、12h、24h、48h五個時間點。采用Western blot方法檢測培養(yǎng)上清液HMGB1的含量。4、不同劑量的EP對人臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌HMGB1的作用。細胞分三組(EPOuM組、5uM組、10uM組)，采用Western blot方法檢測培養(yǎng)上清液HM

5、GB1的含量。 結(jié)果：第一部分實驗：急性肝損傷組ALT、Endotoxin含量顯著高于正常對照組(P<0.01)，丙酮酸乙酯預(yù)防組ALT、Endotoxin含量仍高于正常對照組，但顯著低于急性肝損傷組(P<0.05)。病理組織HE染色觀察可見對照組大鼠腸粘膜表面絨毛排列整齊、柱狀上皮細胞結(jié)構(gòu)完整；肝損傷組大鼠腸粘膜表現(xiàn)為間質(zhì)充血水腫，絨毛頂端下間隙增寬，絨毛脫落壞死；EP預(yù)防組改變較損傷組減輕。免疫組化結(jié)果可見ZO-1正常時均勻

6、一致地分布于小腸上皮細胞連接處的尖端；肝損傷組ZO-1分布不均、染色變淡，EP預(yù)防組介于二者之間。第二部分實驗：急性肝損傷組ALT、TNF-α含量顯著高于正常對照組(P<0.01)，丙酮酸乙酯治療組ALT、TNF-α含量仍高于正常對照組，但顯著低于急性肝損傷組(P<0.01)。各時間點血漿HMGB1含量變化Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組大鼠血漿中未檢測到HMGB1；ALI組HMGB1含量為171.75±18.80ng/ml

7、；EP組HMGB1含量為78.79±8.55ng/ml。EP組HMGB1含量顯著低于ALI組(p<0.01)。第三部分實驗：原代培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞vWF因子經(jīng)免疫組化檢測證實原代及傳代培養(yǎng)的細胞為人臍靜脈內(nèi)皮細胞。臍靜脈內(nèi)皮細胞ICAM-1、HMGB1表達免疫組化結(jié)果顯示：未刺激時HMGB1聚集在細胞核內(nèi)，細胞核呈棕色深染；LPS組刺激后HMGB1從細胞核釋放，胞漿染色加深；EP組HMGB1釋放被部分抑制，胞漿染色變淺。未刺激時細胞膜、

8、胞漿表面ICAM-1微弱表達：LPS組ICAM-1在胞膜及胞漿中的表達呈強陽性，胞漿呈深棕色染色；EP組ICAM-1在胞膜及胞漿中的表達明顯減弱。培養(yǎng)上清液中HMGB1含量變化檢測：LPS組上清液HMGB1含量隨誘導時間延長明顯增高，呈時間依賴方式，24h達分泌高峰；EP組上清液HMGB1含量變化趨勢與LPS組一致，但HMGB1含量明顯降低(p<0.05)。不同劑量的EP對人臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌GMGB1的作用結(jié)果顯示各細胞組于LPS10

9、0ng/ml刺激16h后，EP5uM劑量組對HMGB1分泌具有一定的抑制作用，與EP0uM組比，HMGB1含量明顯降低(p<0.05)；10uM劑量組與0uM組比p<0.01：而且10uM劑量組與5uM劑量組比p<0.05，具有顯著差異。 結(jié)論： 1、丙酮酸乙酯可以增加急性肝損傷時腸粘膜上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1的表達，可以阻止腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。 2、丙酮酸乙酯可以抑制急性肝損傷時枯否細胞釋放TNF-α、