抗MRSA-PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白單克隆抗體的制備、鑒定與初步應(yīng)用.pdf

1、目的： 制備能穩(wěn)定分泌高效價、高特異性抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白的單克隆抗體(mAb)，進(jìn)而建立敏感、特異的檢測PBP2a的乳膠凝集法，為研制MRSA快速鑒定試劑盒奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、優(yōu)化免疫方案，以基因工程重組PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白為抗原，與福氏佐劑混合形成油包水的乳狀顆粒，免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與小鼠NS-1骨髓瘤細(xì)胞融合，用間接ELISA

2、法篩選陽性克隆孔，有限稀釋法進(jìn)行陽性孔克隆化。經(jīng)過反復(fù)篩選及4次克隆化后，獲得能穩(wěn)定分泌抗PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞注入經(jīng)降植烷預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔制備腹水型mAb，采用簡便、快速的辛酸-硫酸銨法對腹水進(jìn)行純化。對所制備的mAb進(jìn)行了鑒定，包括染色體分析、免疫球蛋白亞型及亞類鑒定、親和常數(shù)測定、特異性鑒定、中和抑制作用分析及穩(wěn)定性鑒定。 2、用堿裂解法提取MRSA細(xì)胞壁上的膜蛋白，與抗PBP

3、2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白mAb致敏(物理吸附法)的乳膠進(jìn)行反應(yīng)，建立了檢測PBP2a的乳膠凝集法。應(yīng)用初步建立的乳膠凝集法，對臨床分離的20株金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，并將其結(jié)果與Biomerieux. 結(jié)果： 1、以50gg抗原間隔21天足墊加皮下免疫所獲得抗血清效價最高，取脾融合后獲得2株能穩(wěn)定分泌抗PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為F1和F2，兩株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目為兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目之和； 2株均為

4、IgG1類；腹水效價分別為0.5×10<'6>和1×10<'6>，親和力常數(shù)分別為1.57×10<'8>M<'-1>和5.43×10<'8>M<'-1>；Western blot顯示F1、F2抗體均能有效識別重組PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白及MRSA臨床分離株中的天然PBP2a； 中和抑制試驗表明雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、腹水中的抗體能明顯被重組PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白所中和；用辛酸一硫酸銨法純化的IgG1型mAb達(dá)到電泳純，純化前后mAb效價無改變

5、； 2株雜交瘤細(xì)胞株在液氮凍存半年后仍能穩(wěn)定分泌特異性的mAb。 2、建立的乳膠凝集檢測法特異性、敏感性和穩(wěn)定性良好，初步臨床驗證顯示其能夠準(zhǔn)確檢測耐甲氧西林葡萄球菌，對耐甲氧西林葡萄球菌感染的快速鑒定具有良好的應(yīng)用價值。 結(jié)論： 1、50μg抗原間隔21天足墊加皮下免疫為本試驗中最佳免疫方案。 2、成功制備了2株特異性好、親和力強(qiáng)，能穩(wěn)定分泌抗PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株。 3、建