洛伐他汀產(chǎn)生菌的選育.pdf

1、洛伐他汀（lovastatin，也稱莫那可林K，monacolin K）是一種來源于微生物HMG-CoA（羥甲基戊二酰輔酶A）還原酶抑制劑，是用于治療高膽固醇癥的藥物，它能阻止動脈硬化發(fā)展，減少心肌梗塞等發(fā)病的危險，因此在醫(yī)學上具有重要意義。目前美國和日本等國家已開發(fā)出一系列的他汀類藥物，但我國對降脂紅曲霉的研究還相對落后，生產(chǎn)中普遍存在產(chǎn)量偏低、生產(chǎn)成本偏高等問題。究其原因，一方面是培養(yǎng)工藝的不足，另一方面是優(yōu)良菌株的缺乏。因而進行洛

2、伐他汀產(chǎn)生菌的選育具有重大意義。洛伐他汀的主要產(chǎn)生菌為土曲霉（Aspergillus terreus）和紅曲霉(Monascus spp.)。紅曲霉不僅產(chǎn)生洛伐他汀，而且產(chǎn)生monacolin J、L、X，這些物質(zhì)都是HMG-CoA還原酶抑制劑，具有很強的降低膽固醇功能。而且紅曲色素作為一種天然色素，在我國廣泛應用于清酒、醬油、腐乳、豆醬、魚、肉、糕點等食品的著色。同時土曲霉是現(xiàn)在國內(nèi)生產(chǎn)洛伐他汀的原始出發(fā)菌，它具有優(yōu)良的發(fā)酵性能、較高

3、的洛伐他汀產(chǎn)生能力、成熟的發(fā)酵工藝。原生質(zhì)體融合技術是現(xiàn)代菌種選育技術之一，它與一般基因重組方法不同，不需遺傳標記，對改良生產(chǎn)菌株性能可能更有效。本研究將通過土曲霉和紅曲霉滅活原生質(zhì)體融合技術，將土曲霉生產(chǎn)菌優(yōu)良的發(fā)酵性能、較高的洛伐他汀產(chǎn)生能力、成熟的發(fā)酵工藝和紅曲霉他汀類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性、色素產(chǎn)生能力以及長期實踐證明的安全性結(jié)合起來，選育洛伐他汀高產(chǎn)菌株。 目的:將具有較高洛伐他汀產(chǎn)生能力的土曲霉和具有他汀類化合物結(jié)構(gòu)多樣

4、性的紅曲霉原生質(zhì)體融合在一起使其發(fā)生基因重組，通過滅活原生質(zhì)體法初步篩選融合子，再通過洛伐他汀產(chǎn)量測定篩選高產(chǎn)洛伐他汀的融合子，并對目的融合子進行傳代培養(yǎng)以確保其遺傳穩(wěn)定性。 方法:對土曲霉與紅曲霉的生長曲線和洛伐他汀產(chǎn)生曲線進行探討，研究紅曲霉色素形成的曲線；考察不同酶解時間對原生質(zhì)體制備與再生的影響，確定紫外線滅活原生質(zhì)體的時間；比較紫外分光光度法和高效液相色譜法測定洛伐他汀含量的差異，確定洛伐他汀的定量方法；篩選高產(chǎn)洛伐他

5、汀融合子，對其進行了生長特性研究，并傳代確定其遺傳穩(wěn)定性。 結(jié)果: 1.土曲霉搖瓶培養(yǎng)第3天為對數(shù)生長期，第7~8天洛伐他汀增長最快；紅曲霉搖瓶培養(yǎng)第2天為對數(shù)生長期，第5~7天洛伐他汀增長最快。紅曲色素在前9天緩慢增長，到第10天開始迅速增長。 2.土曲霉和紅曲霉用混合酶液分別酶解5小時和3.5小時制得的原生質(zhì)體較多，再生率較高，加石英砂效果更好。土曲霉和紅曲霉原生質(zhì)體在紫外線（30cm，20W）下分別照射5m

6、in和4min可100％滅活。 3.建立了兩種對洛伐他汀的定量分析方法。一是高效液相色譜法（HPLC），二是紫外分光光度法。實驗表明HPLC法在0~50?g/ml濃度范圍內(nèi)對積分面積與洛伐他汀具有良好的線性關系，y=44813x-1330.6，R2=1；而使用紫外分光光度法，洛伐他汀含量與OD值亦呈線性關系，y=0.0952x+0.1093，R2=0.9773，精確度稍差，但可達到本實驗的篩選目的。 4.本實驗在87株融