毒氟磷抗體制備及其手性識別特性研究.pdf

1、毒氟磷是一種新型、高效的植物抗病毒劑，由貴州大學(xué)精細(xì)化工研究開發(fā)中心研究、開發(fā)。目前被廣泛的應(yīng)用在番茄和黃瓜病毒病、煙草花葉病毒病以及南方水稻黑條矮縮病。ELISA檢測方法不存在儀器法上的缺點，可以大批量的對檢測樣品進(jìn)行篩選，在小分子農(nóng)藥殘留上被廣泛應(yīng)用。
　　本論文合成不同結(jié)構(gòu)的毒氟磷半抗原(DHS和 DHL)，選擇碳二亞胺法將半抗原與蛋白偶聯(lián)，偶聯(lián)后免疫兔子獲得抗體，并用高碘酸鈉法及HRP酶對抗體進(jìn)行了標(biāo)記。同時通過優(yōu)化包被原

2、的包被濃度與抗體的稀釋倍數(shù)，建立直接競爭ELISA方法。將抗體和相應(yīng)的異構(gòu)體之間進(jìn)行交叉反應(yīng)，研究抗體的特異性手性識別。并通過8種毒氟磷結(jié)構(gòu)類似物的抗原與抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)，進(jìn)一步研究抗原與抗體的構(gòu)效關(guān)系。取得以下研究結(jié)果。
　　(1)設(shè)計、合成毒氟磷半抗原(DHS和DHL)，并通過核磁共振(1H-NMR,13C-NMR)、質(zhì)譜(MS)和紅外光譜(IR)鑒定半抗原的結(jié)構(gòu)。制備6種免疫原X-DHS/DHL-BSA、S-(+)-DHS/

3、DHL-BSA和R-(-)-DHS/DHL-BSA和6種包被原X-DHS/DHL-OVA、S-(+)-DHS/DHL-OVA和R-(-)-DHS/DHL-OVA通過全波長紫外光譜法鑒定偶聯(lián)成功，獲得6種毒氟磷的多克隆抗體。采用間接競爭 ELISA方法檢測抗血清，研究結(jié)果表明：血清效價較高的為1:80000，最低的血清效價為1:10000。成功測定了抗體的親和常數(shù)。X-DHS/DHL的酶標(biāo)多克隆抗體親和常數(shù)Ka分別為2.5×109和3.0

4、×109 L/mol，S-(+)- DHS/DHL的酶標(biāo)多克隆抗體Ka分別為2.2×109和1.8×109 L/mol，R-(-)-DHS/DHL的酶標(biāo)多克隆抗體Ka分別為5.0×109和5.3×109 L/mol。
　　(2)建立的ELISA檢測方法在1-5000 ng/mL內(nèi)，抗原抗體結(jié)合率B/B0(％)與毒氟磷的濃度對數(shù)(lgC)的線性關(guān)系，線性回歸方程為B/B0=-15.8lgC+68.4，線性系數(shù)分別為R2=0.9986

5、。抑制50%時的毒氟磷濃度分別為IC50=37.5 ng/mL，若以80%的結(jié)合率作為最低檢出量，則毒氟磷在該方法下的檢出限為IC20=2.8 ng/mL。用 ELISA方法檢測番茄、黃瓜、大米和煙草，其日內(nèi)和日間的回收率分別為70.0-87.3%和70.2-80.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.1-11.2%和8.4-12.1%。同時也建立了 LC-MS/MS方法檢測毒氟磷在番茄、黃瓜、大米和煙草，其所有樣品基質(zhì)中的日內(nèi)和日間的回收率分別

6、為71.9-93.6%、74.5-91.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.9-8.5%和6.9-15.2%。
　　(3)在6種多克隆抗體的特異性識別試驗中，X-DHS/DHL與S-(+)-DHS/DHL和 R-(-)-DHS/DHL的抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)，其交叉反應(yīng)率大約在100%，表明X-DHS/DHL抗體不能識別相應(yīng)的旋光異構(gòu)體。而 S-(+)-DHS/DHL和 R-(-)- DHS/DHL的多克隆抗體有相應(yīng)的手性識別位點。