抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥scFab抗體的制備及其特性分析.pdf

1、二乙氧基硫代磷酸酯類（DPPs）有機(jī)磷農(nóng)藥是一類具有硫代磷酸二乙酯官能團(tuán)的有機(jī)磷農(nóng)藥，曾廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中。誤用或?yàn)E用DPPs類農(nóng)藥往往導(dǎo)致環(huán)境、食品及藥品的污染，甚至造成生物和人類的中毒或死亡。因此，迫切需要監(jiān)測(cè)DPPs類農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中的殘留。免疫檢測(cè)分析是近年來小分子有毒有害物檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而基因工程抗體的構(gòu)建是獲取免疫分析方法核心原材料的新途徑。目前，研究較多的重組抗體包括單鏈抗體scFv和Fab抗體，這兩種抗體各有優(yōu)缺

2、點(diǎn)，其中scFv相比Fab抗體的穩(wěn)定差，而Fab表達(dá)效率低于scFv。鑒于此，本研究通過制備一種新型的抗DPPs單鏈Fab抗體，即scFab，對(duì)其特性進(jìn)行分析，期望獲得同時(shí)具備高表達(dá)效率及高穩(wěn)定性的重組抗體。具體研究工作及結(jié)果如下：
　?。?）兩種抗DPPs scFab表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
　　設(shè)計(jì)引物，以前期獲得的抗DPPs的Fab抗體基因?yàn)槟０澹謩e擴(kuò)增出兩套抗體κ鏈、Fd段基因。第一套κ鏈和Fd段基因，其5‘端和3‘端

3、分別插入Sac I和Xba I、Xho I和Spe I限制性酶切位點(diǎn)，第二套κ鏈和Fd段基因，其5‘端和3‘端分別插入Xho I和SpeI、SacI和XbaI限制性酶切位點(diǎn)，得到的Fd段基因大小約670 bp，κ鏈基因大小約為650 bp，與預(yù)期相符。將Fd段與κ鏈基因插入到經(jīng)酶切的pComb3XSS載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coliTOP10F?，重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，最終成功構(gòu)建了兩種重、輕鏈順序不同的抗DPPs s

4、cFab表達(dá)載體pComb3XSS-DPPs-scFab-Fd-κ、pComb3XSS-DPPs-scFab-κ-Fd。挑取陽性克隆，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE和western blotting鑒定。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為50 kDa，大小與預(yù)期結(jié)果一致。Western-Blotting分析顯示，目的蛋白帶能夠與鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，表明重、輕鏈順序不同的scFab-Fd

5、-κ和scFab-κ-Fd兩種抗體蛋白表達(dá)成功。
　?。?）抗DPPs scFab的活性鑒定
　　利用icELISA對(duì)表達(dá)制備的scFab-κ-Fd和scFab-Fd-κ進(jìn)行活性鑒定。結(jié)果顯示：scFab-κ-Fd對(duì)蠅毒磷和對(duì)硫磷兩種藥物IC50值分別為1.5 ng/mL和3.1 ng/mL，scFab-Fd-κ對(duì)兩種藥物的IC50同前分別為3.7μg/mL和8.5μg/mL。另外12種農(nóng)藥的抑制實(shí)驗(yàn)顯示，即使藥物濃度達(dá)到1

6、 mg/mL，scFab-Fd-κ也沒有明顯的抑制現(xiàn)象，而scFab-κ-Fd則表現(xiàn)較好的活性。
　?。?）抗DPPs scFab特性分析
　　取相同表達(dá)條件下的scFab-κ-Fd、scFv及Fab周質(zhì)腔提取物進(jìn)行抗體表達(dá)水平、特異性及穩(wěn)定性分析。Western-Blotting分析顯示：Fab重組菌誘導(dǎo)表達(dá)周質(zhì)腔提取物濃縮4倍，可見一條約23 kDa的條帶。scFv和scFab-κ-Fd重組菌誘導(dǎo)表達(dá)周質(zhì)腔提取物，不經(jīng)濃

7、縮，分別在25 kDa和50 kDa顯示清晰的條帶。周質(zhì)腔提取物初始效價(jià)的比較顯示：scFab能夠結(jié)合包被原的濃度與scFv相似，但高于 Fab。說明在周質(zhì)腔提取物中，scFab表達(dá)水平與scFv的相似，F(xiàn)ab較低。icELISA結(jié)果顯示：scFab抗體的靈敏度與 scFv相比略低，與 Fab的一致。穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示：在孵育過程中，抗體包被原結(jié)合活性下降的幅度為Fab< scFab

8、而scFv靈敏度下降幅度較大。說明scFab和Fab比 scFv穩(wěn)定。
　?。?）基于抗DPPs scFab的icELISA用于實(shí)際樣品檢測(cè)
　　取生菜、黃瓜及白菜為蔬菜樣品，經(jīng)QuEChERS前處理凈化后，選擇4種代表性二乙氧基硫代磷酸類有機(jī)磷農(nóng)藥（對(duì)硫磷、除線磷、辛硫磷和喹硫磷）進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：白菜、黃瓜以及生菜樣品中 DPPs有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率分別在81.2~121.8％、90.8~116.1%和82.7