轉(zhuǎn)基因大豆流式熒光雜交檢測(cè)體系的研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因安全性問題逐漸成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。為此，相關(guān)國家和地區(qū)采取轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度，加強(qiáng)對(duì)其監(jiān)管的力度。目前，轉(zhuǎn)基因生物品系繁多、數(shù)量巨大，經(jīng)深加工后其成分又遭到一定程度的破壞，不僅增加了檢測(cè)的工作量，也增加了檢測(cè)的難度。就現(xiàn)有的檢測(cè)手段，早已無法滿足目前多品系、高通量、高特異、高靈敏的快速檢測(cè)需求。
　　本研究將靶序列富集多重-聚合酶鏈反應(yīng)和流式熒光雜交檢測(cè)系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合起來，建立一種在單個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)

2、五種轉(zhuǎn)基因大豆的方法，實(shí)現(xiàn)包括轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、CV127和305423的高通量、高特異和高靈敏的快速檢測(cè)。研究?jī)?nèi)容如下：
　　首先，在Genbank上檢索五種轉(zhuǎn)基因大豆外源基因序列和內(nèi)源基因Lectin序列，通過iCubate2.0在線軟件計(jì)算外源基因連接區(qū)域序列的多聚酶親和指數(shù)值(PPI)曲線，并利用 PrimerPrimer5.0、Beacon Designer等軟件設(shè)計(jì)12對(duì)

3、特異性內(nèi)外引物(Fi/Ri和Fo/Ro)、一對(duì)通用超級(jí)引物(Fs/Rs)和六條特異性捕獲探針，其中內(nèi)外引物3′端均位于高PPI值區(qū)域內(nèi)，再通過調(diào)整引物長度改變Tm值，而內(nèi)引物(Fi/Ri)的5′端分別添加一段能夠被Fs/Rs所識(shí)別的通用序列。
　　其次，建立五種轉(zhuǎn)基因大豆的Tem-PCR反應(yīng)體系。低濃度的Fo/Ro和Fi/Ri只對(duì)靶序列進(jìn)行富集和加標(biāo)簽，高濃度的Fs/Rs對(duì)所有靶序列進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，克服了常規(guī)多重PCR的高背景、擴(kuò)增

4、效率不一致等難題。
　　最后，建立六種靶序列的流式熒光雜交檢測(cè)體系。Rs的5′端標(biāo)記生物素，其Tem-PCR產(chǎn)物均含有生物素標(biāo)簽，與微球探針進(jìn)行雜交后，可與熒光報(bào)告分子（鏈親和霉素-藻紅素）結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)值，經(jīng)Bio-PlexTM200系統(tǒng)讀取分析，可判斷被檢測(cè)體系中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。
　　本研究針對(duì)五種轉(zhuǎn)基因大豆成功建立了基于靶序列富集多重-聚合酶鏈反應(yīng)的流式熒光雜交檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了五種轉(zhuǎn)基因大豆品系的高通量、高特異、