轉(zhuǎn)基因大豆MON87705及其產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、1983年，世界上第一例轉(zhuǎn)基因作物—轉(zhuǎn)基因煙草由美國(guó)研究人員成功培育。自此轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅猛，同時(shí)各國(guó)政府也制定了相關(guān)政策法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品實(shí)施監(jiān)督管控。建立準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)方法是實(shí)現(xiàn)監(jiān)管的前提。轉(zhuǎn)基因大豆MON87705是孟山都公司研發(fā)的品質(zhì)改良抗除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物。它是利用二元質(zhì)粒載體PV-GMPQ/HT4404通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化常規(guī)大豆A3525的分生組織得到的，含有FAD2-1A/FATB1Ab表達(dá)抑制盒和cp4

2、-epsps耐除草劑基因。
　　研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆MON87705外源插入DNA和植物基因組結(jié)點(diǎn)區(qū)域序列查找相關(guān)文獻(xiàn)并設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)引物，進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增，通過引物篩選和優(yōu)化反應(yīng)條件獲得最佳反應(yīng)體系，從而建立轉(zhuǎn)基因大豆MON87705轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)方法。隨著對(duì)轉(zhuǎn)基因安全性研究的深入，僅僅定性已經(jīng)不能滿足檢測(cè)要求，因此進(jìn)一步設(shè)計(jì)合適的探針與引物，研究該轉(zhuǎn)化事件的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用于比對(duì)轉(zhuǎn)基因成分含

3、量。同時(shí)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大豆MON87705陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子替代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以解決標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲取困難的問題。主要研究結(jié)果如下：
　　1、將轉(zhuǎn)基因大豆MON87705相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的定性PCR引物與運(yùn)用Primer Express3.0軟件自行設(shè)計(jì)4條轉(zhuǎn)化體特異性引物進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)MON87705GF/GR（318bp）擴(kuò)增效率高于其他引物。其最適退火溫度為58℃。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該定性 PCR檢測(cè)方法的特異性、靈敏度和重演性，在DNA含量為0.1

4、％及以上時(shí)都能擴(kuò)增出318bp目的條帶，表明該轉(zhuǎn)基因大豆的定性檢測(cè)方法靈敏度較高，為0.1%。選取7家已通過“2+1認(rèn)證”的轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)機(jī)構(gòu)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證，所有驗(yàn)證單位均從含量為0.1%的MON87705大豆樣品中擴(kuò)增獲得目的片段。說明該檢測(cè)方法適合作為轉(zhuǎn)基因大豆MON87705及其產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆MON877053＇端側(cè)翼序列設(shè)計(jì)定量引物及探針并進(jìn)行篩選優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)引物MON877

5、05qF/qR和探針MON87705qP熒光信號(hào)強(qiáng)，重復(fù)性好。對(duì)該引物探針組合進(jìn)行特異性和靈敏度驗(yàn)證，結(jié)果表明其特異性強(qiáng)，檢測(cè)極限為15個(gè)拷貝。
　　3、通過重組PCR的方法將MON877053＇端插入序列和大豆內(nèi)標(biāo)lectin序列組合到一起，然后將其連接到pMD18-T上，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大豆MON87705標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-87705。通過測(cè)序分析該重組序列完整地插入到載體當(dāng)中。使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-87705進(jìn)行定性、定量PC