用于亞細(xì)胞定位的三種植物原生質(zhì)體分離體系的建立與優(yōu)化.pdf

1、植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁由質(zhì)膜包被的裸露細(xì)胞。與完整的植物細(xì)胞相比，植物原生質(zhì)體較為脆弱，但其一樣含有完整遺傳物質(zhì)，具有全能型，具有再生新植株的潛能。原生質(zhì)體可以高效攝取外界DNA、細(xì)胞器、病毒等物質(zhì)，還可與與其不親和植株的原生質(zhì)體相互融合進(jìn)而分化產(chǎn)生新植株。植物原生質(zhì)體在生物基礎(chǔ)理論研究、作物品種改良、基因瞬時(shí)表達(dá)及蛋白的亞細(xì)胞定位等研究中具有十分重要的意義。
　　植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素和果膠。本研究以課題組內(nèi)研

2、究較為廣泛且較具研究前景的三種植物:鷹嘴豆、大豆的幼嫩真葉及梭梭的幼嫩同化枝為材料，研究了不同酶解液組合、不同酶解液中甘露醇濃度、不同頇處理時(shí)間、不同酶解液pH以及不同酶解時(shí)間對(duì)三種植物材料原生質(zhì)體分離的影響，旨在分離數(shù)量較大且具有較高活力的原生質(zhì)體，以為后期原生質(zhì)體培養(yǎng)、融合、基因的瞬時(shí)表達(dá)及蛋白的亞細(xì)胞定位等研究提供技術(shù)支持。具體結(jié)果如下:
　　1.建立了kabuli型鷹嘴豆原生質(zhì)體快速分離體系。以10-30 d苗齡的鷹嘴豆幼

3、嫩葉片作為游離材料，其最佳原生質(zhì)體分離條件為于CPW-M13溶液中質(zhì)壁分離處理3h后轉(zhuǎn)入酶解液中，黑暗條件下，27℃恒溫水浴振蕩器上45 rpm震蕩酶解7-8 h。其最佳酶解液組合成分為0.5％纖維素酶Onozuka R-10+0.8％半纖維素酶Hemicellulase+0.8％離析酶Macerozyme R-10+0.1％ MES+10％甘露醇溶于CPW溶液中，pH為4.8。
　　2.建立了大豆品種湘豆3號(hào)原生質(zhì)體快速分離體系

4、。以10-30 d苗齡的湘豆3號(hào)的幼嫩真葉作為游離材料，其最佳原生質(zhì)體分離條件為于CPW-M13溶液中質(zhì)壁分離處理2h后轉(zhuǎn)入酶解液中，黑暗條件下，27℃恒溫水浴振蕩器上45 rpm震蕩酶解6h。其最佳酶解液組合成分為0.5％纖維素酶Onozuka R-10+0.8％半纖維素酶Hemicellulase+0.8％離析酶Macerozyme R-10+0.4％果膠酶Pectolyase Y-23+0.1％MES+10％甘露醇溶于CPW溶液中