擬南芥醇腈酶基因(AtHNL)啟動子的克隆及其應答非生物脅迫和激素反應的初步分析.pdf

1、醇腈酶(hydroxynitrile lyase，HNL; Oxynitrilase，E.C.4.1.2.x)，作為一種生物催化劑，能可逆地催化氰化氫(HCN)和醛或酮類化合物反應生成手性氰醇化合物或手性藥物。根據(jù)其催化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型，HNL分為R型和S型。目前，兩種類型HNL在工業(yè)上均得到了廣泛的應用。在自然界中，HNL主要作為有機體的一種裂解酶用于分解醇腈而產(chǎn)生HCN，該過程稱為生氰作用。植物體內(nèi)由于HNL對氰醇的生物催化反應釋放出

2、HCN，主要用于抵御食草動物、真菌的侵襲和機械破壞。此外，氰醇作為生氰的糖苷主要用來儲存氫氰酸，同時參與氮源的轉(zhuǎn)運和新陳代謝。盡管目前已報道的產(chǎn)氰植物超過有4000種。作為HNL催化反應的副產(chǎn)物，HCN被認為最多的是與抑制線粒體修復途徑中的末端細胞色素氧化酶活性有關(guān)。不過越來越多的數(shù)據(jù)表明，HCN可能在植物的許多生理過程中起到調(diào)節(jié)作用（包括種子萌發(fā)、硝酸鹽吸收及響應外界環(huán)境刺激等）。
　　最近，通過序列比對及分析，擬南芥中報道了一

3、個具有α/β水解酶活性的R型HNL(AtHNL)，且具有較高的催化活性扣對映體選擇性而具有較高的工業(yè)應用前景。上述結(jié)果暗示傳統(tǒng)的非生氰植物中可能存在酶促產(chǎn)生HCN的途徑。此外，基因芯片結(jié)果表明，AtHNL基因顯著的受冷害、NaC1及干旱脅迫的誘導表達，不過AtHNL是否存在誘導調(diào)節(jié)機制，其上游啟動子序列中是否存在受逆境脅迫調(diào)控的元件需要進一步的闡述。此外，AtHNL基因是否在非生物脅迫中起到調(diào)控作用也需要深入研究。因此，本研究通過克隆和

4、分析AtHNL啟動子序列，通過轉(zhuǎn)基因擬南芥，及結(jié)合非生物脅迫和激素處理下啟動子的表達調(diào)控模式研究，為加深和理解AtHNL基因的調(diào)節(jié)機制，并對AtHNL在植物響應外界環(huán)境刺激中可能起到的作用提供一定的理論研究意義。此外，本研究還對AtHNL啟動子中可能存在新的順式作用元件進行發(fā)掘。
　　在本研究中，為了研究AtHNL啟動子的表達特征，首先克隆了長約2.1kb的AtHNL啟動子序列（pHNL，-2023至+67），以及pHNL的一系列

5、相關(guān)5'缺失的片段（5D1，-933到+67;5D2，-733到+67;5D3，-533到+67;5D4，-333到+67;5D5，-133到+67）;通過構(gòu)建表達載體，將所有克隆到的啟動子片段融合到GUS（β-glucuronidase）基因的上游后，用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得的轉(zhuǎn)基因植株，用于分析外界刺激（尤其是干旱、高鹽和冷脅迫）及激素處理對AtHNL啟動子調(diào)控表達的影響。結(jié)果表明:pHNL能夠響應鹽脅迫，凍害及茉莉酸甲酯(MeJA)

6、的誘導。這可能與啟動子序列中含有的環(huán)境脅迫誘導及茉莉酸響應元件有關(guān);此外，AtHNL啟動子還明顯受干旱、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)不同程度的負調(diào)控表達，這可能與啟動子中的CGTCA-motif，TATC-box，GARE-motif, TCA-element等關(guān)鍵作用元件的分布有關(guān)。此外，序列截短實驗表明:5D1、5D2、5D4和5D5轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性較pHNL高;而5D3片段轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性基本檢測不