氮代謝調(diào)控因子Dal80p對黃酒釀造中氨基甲酸乙酯形成的影響.pdf

1、黃酒是我國傳統(tǒng)釀造食品，因其獨特的風味和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)廣受消費者喜愛。但研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵酒精飲品中存在氨基甲酸乙酯，并且對試驗動物造成多位點致癌。2007年國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將氨基甲酸乙酯提升為對人類具有潛在致癌性的物質(zhì)（2A級別）。因為發(fā)酵飲品中氨基甲酸乙酯會對飲酒人群的健康造成威脅，所以對氨基甲酸乙酯的安全調(diào)控是目前黃酒釀造中面臨的主要科學(xué)難題。黃酒中氨基甲酸乙酯形成的主要前體物為尿素，并且尿素主要來源于發(fā)酵原料和發(fā)酵后期釀酒

2、酵母對精氨酸的降解，而精氨酸的代謝主要受氮代謝抑制的調(diào)控。本研究將基于氮代謝抑制調(diào)控機制來探究黃酒中氨基甲酸乙酯的調(diào)控途徑。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)釀造后期添加硫酸銨作為補充氮源，并且對釀造過程中精氨酸濃度、尿素濃度、氨基甲酸乙酯濃度，和釀造產(chǎn)品中酒精度、風味物質(zhì)組成、氨基酸組成的測定結(jié)果表明:發(fā)酵20天時添加5g/L硫酸銨使發(fā)酵液中精氨酸濃度明顯比不添加硫酸銨的對照組濃度高，尿素與氨基甲酸乙酯的濃度分別比對照組降低2

3、4％和16％，發(fā)酵產(chǎn)品的酒精度、風味物質(zhì)組成以及氨基酸組成與對照組差異不大。
　　采用釀酒酵母BY4741和SC替代酒藥（對照組）進行釀造，并且對釀造過程中精氨酸濃度、尿素濃度、氨基甲酸乙酯濃度，和釀造產(chǎn)品中酒精度、風味物質(zhì)組成、氨基酸組成的測定結(jié)果表明:釀造過程中精氨酸濃度始終低于對照組，而尿素和氨基甲酸乙酯的濃度與對照組中差異不大，發(fā)酵產(chǎn)品的酒精度、風味物質(zhì)組成以及氨基酸組成差異不大。因此，在后續(xù)的研究中可以應(yīng)用釀酒酵母BY4

4、741和SC替代酒藥作為研究對象，來探究氨基甲酸乙酯形成的分子學(xué)基礎(chǔ)。
　　(2)應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法對三種不同培養(yǎng)條件下的釀酒酵母氮代謝相關(guān)基因進行分析，高氮水平組中基因表達水平作為參照（低氮水平組:YNB培養(yǎng)基中添加2mM硫酸銨和20mM精氨酸;高氮水平組:YNB培養(yǎng)基中添加40mM硫酸銨和20mM精氨酸;添加雷帕霉素組，YNB培養(yǎng)基中添加40mM硫酸銨、20mM精氨酸和20nM雷帕霉素）。結(jié)果表明:1.低氮處理（低氮組vs高

5、氮組）和添加雷帕霉素處理（雷帕霉素組vs高氮組）條件下，差異基因富集的代謝通路都主要包括碳水化合物代謝和氨基酸代謝。2.在低氮條件下（低氮組vs高氮組），大部分受氮代謝抑制調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄水平均有提高，這與報道中脯氨酸作為唯一氨基酸氮源時相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平一致。3.低氮處理（低氮組vs高氮組）和添加雷帕霉素處理（雷帕霉素組vs高氮組）條件下差異表達基因僅有少量基因轉(zhuǎn)錄水平變化一致（69個基因上調(diào)表達，9個基因下調(diào)表達），說明TOR信號途徑

6、和氮代謝抑制之間是兩條平行的代謝通路。4.在低氮條件下，氨代謝抑制調(diào)控機制的四個轉(zhuǎn)錄因子中僅有Dal80p表達量顯著提高，基于已有報道中Dal80p對DUR1，2的轉(zhuǎn)錄抑制作用，本研究將Dal80p作為氨基甲酸乙酯的潛在調(diào)控因子。
　　(3)對Dal80p與Gln3p鋅指結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)比對結(jié)果表明，Dal80p與Gln3p的核酸結(jié)合域高度同源。Dal80p分別與CAR1和DUR1，2的凝膠遷移實驗(EMSA)表明Dal80p對精

7、氨酸降解酶編碼基因CAR1結(jié)合作用較弱，而對于尿素降解酶編碼基因DUR1，2結(jié)合作用較強，這說明Dal80p對尿素降解酶具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　(4)以DAL80敲除菌為研究對象，開展在低氮模擬發(fā)酵體系中的氮代謝水平研究，對酵母細胞生長曲線、精氨酸濃度、尿素濃度、精氨酸酶活性、脲酶活性、熒光定量PCR測定結(jié)果表明:1.BY4741和DAL80敲除菌分別在低氮和高氮條件下，酵母細胞生長曲線差異性不大，這說明敲除DAL80基因不影響酵

8、母的生長性能。2.DAL80敲除菌在低氮條件下，精氨酸酶活略高，但發(fā)酵液中精氨酸含量與高氮源條件下差異不大，脲酶活性保持較高水平不受發(fā)酵液中氮源濃度影響，發(fā)酵液中尿素濃度在低氮和高氮下均較低。3.RT-PCR結(jié)果表明敲除DAL80基因能夠提高GAP1、DUR1，2、DUR3的轉(zhuǎn)錄水平，而對CAR1的轉(zhuǎn)錄水平影響不大，該研究結(jié)果與凝膠遷移實驗結(jié)果一致。綜上所述，敲除DAL80不影響酵母細胞的生長性能，而且能夠解除Dal80p對脲酶的抑制作

9、用。
　　應(yīng)用DAL80敲除菌部分替代或者完全替代傳統(tǒng)酒藥進行釀造試驗，對發(fā)酵液中尿素濃度、精氨酸濃度、氨基甲酸乙酯濃度，和釀造產(chǎn)品中酒精度、風味物質(zhì)組成、氨基酸組成的測定結(jié)果表明:1.DAL80敲除菌部分替代或者完全替代酒藥釀造時，發(fā)酵液中精氨酸濃度與BY4741未敲除釀造組水平差異不明顯。2.尿素濃度和氨基甲酸乙酯濃度均比酒藥發(fā)酵組和BY4741未敲除釀造組略低，發(fā)酵30天后氨基甲酸乙酯分別降低19.6％和38.5％。3.釀造

10、產(chǎn)品中酒精度、風味物質(zhì)組成、氨基酸組成與酒藥釀造組差異不明顯?；谠撗芯拷Y(jié)果，應(yīng)用DAL80敲除菌替代酒藥進行釀造能有效抑制氨基甲酸乙酯的形成，同時不影響釀造產(chǎn)品的品質(zhì)。
　　本研究首先基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出Dal80p作為氨基甲酸乙酯產(chǎn)生的潛在抑制因子;然后通過蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合實驗、DAL80敲除菌的代謝基礎(chǔ)研究闡明 Dal80p對尿素代謝的調(diào)控機制，為DAL80敲除菌應(yīng)用于黃酒釀造提供理論基礎(chǔ);最后將DAL80敲除菌應(yīng)用于黃酒