γ-氨基丁酸對梨果實青霉病抗性的誘導作用及相關(guān)機理研究.pdf

1、病原菌侵染是導致果實采后損失的主要因素之一。在當前國內(nèi)外廣泛探索的非殺菌劑型病害控制方法中，誘導抗性技術(shù)和理論是研究的熱點。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA）作為一種新型食品功能因子，已在食品工業(yè)中得到了廣泛應用。近年來的研究表明，GABA作為一種重要的植物代謝產(chǎn)物，在果實采后逆境條件下的代謝調(diào)控、抗性應激反應和環(huán)境脅迫應答中可能均起到了關(guān)鍵作用。但是關(guān)于GABA對果實抗病性影響的研究卻尚為空白。本課題重點

2、分析了GABA對梨果實青霉病抗性的誘導作用及其主要影響因素;并通過分析GABA對病原菌、對梨果實抗性相關(guān)的生理生化反應和抗性相關(guān)的基因表達、對處理后果實的超微結(jié)構(gòu)、品質(zhì)和對梨果實抗性物質(zhì)代謝、GABA代謝途徑的影響等，探討了GABA誘導梨果實抗性的生物學機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.GABA對梨果實抗性誘導的作用規(guī)律
　　1～1000μg/mlGABA在梨果實傷口處對青霉病沒有直接抑制作用，但能誘導梨果實對擴展青霉（Pe

3、nicillium expansum）的抗性，其效力與GABA的濃度、GABA的處理時間以及病原菌濃度等因素密切相關(guān)。在常溫條件下100μg/mlGABA預先處理傷口組織24h后可以顯著降低104spores/mlP.expansum引起的梨果實青霉病，發(fā)病率相比對照組降低了54.5％;而在低溫貯藏的早期（接入病原菌后的第16天），可以完全抑制病害的發(fā)生;整果處理也顯示了較好的控制效力，病害發(fā)生率降低了22.2％。但GABA的誘導抗性效

4、能隨病原菌濃度的升高而下降。
　　此外，GABA處理后的梨果實在一個月的貯藏期的品質(zhì)指標與對照組相比沒有發(fā)生顯著性變化，說明GABA處理并沒有對梨果實品質(zhì)產(chǎn)生負面影響。
　　2.GABA對病原菌和梨果實的作用機理
　　2.1、GABA對擴展青霉在體外和體內(nèi)孢子萌發(fā)的影響
　　1～1000μg/mlGABA在PDA固體培養(yǎng)基和PDB液體培養(yǎng)基中均不能顯著抑制P.expansum的生長;而在果實體內(nèi)，當100μg/m

5、lGABA處理與病原菌接種時間間隔提高到24h后，可以顯著而強烈的抑制組織傷口處P.expansum的孢子萌發(fā)。這些結(jié)果暗示:GABA能夠降低梨果實青霉病的機制可能主要與其能誘導梨果實的抗性有關(guān)。
　　2.2、GABA對梨果實組織超微結(jié)構(gòu)的影響
　　采用SEM和TEM電鏡觀察GABA處理對梨果實傷口組織超微結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)GABA誘導處理后再接入P.expansum的果實組織細胞壁較厚，組織形態(tài)和細胞器保存基本完好，而對照組

6、內(nèi)含物由于大量滲出而減少，且已成碎片狀，部分果實組織和細胞出現(xiàn)崩潰和死亡的現(xiàn)象。以上結(jié)果說明GABA能在細胞組織水平上增強梨果實對病原菌的抗性。
　　2.3、GABA對梨果實抗性相關(guān)生理指標的影響
　　通過測定8個與果實防御系統(tǒng)相關(guān)的生理生化指標并利用激光共聚焦顯微鏡觀察ROS在組織細胞爆發(fā)情況表明，GABA誘導處理后再接入P.expansum果實組織的多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)

7、、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性相比GABA或P.expansum單獨處理組均呈現(xiàn)顯著而快速提高的趨勢，而細胞過量的活性氧(ROS)被有效清除，丙二醛(MDA)含量降低，同時GABA處理還誘導了與病原菌直接作用的幾丁質(zhì)酶(CHI)和β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性的顯著增強。以上結(jié)果表明，GABA處理能激發(fā)梨果實抗性相關(guān)防御酶系和病程相關(guān)酶活性，并且可能存在Priming機制。
　　2.4、GABA對梨果實抗性相

8、關(guān)基因表達情況的影響
　　利用RT-PCR對梨果實的PpPPO，PpPOD家族基因、PpPAL、PpCHI家族基因和PpGLU進行擴增后，均得到預期大小的單一目的片段。GABA和P.expansum處理后PpPOD3表達量下調(diào)，PpPOD4、PpCHI2和PpCHI3表達量沒有顯著變化。家族基因基因結(jié)構(gòu)上的差異最終導致功能上的不同，由此推測PpPOD3、PpPOD4、PpCHI2、PpCHI3可能不參與果實抗性防御反應中POD、C

9、HI酶活性的調(diào)控，因此選擇PpPOD1和PpCHI4為果實防御系統(tǒng)的抗性調(diào)控目的基因，利用qPCR對其進行定量測定。
　　qPCR結(jié)果證明GABA+P.expansum處理顯著誘導梨果實的PpPPO、PpPOD1、PpPAL、PpCHI4以及PpGLU基因表達，并展現(xiàn)出更強更快的激發(fā)效果，明顯快于和高于P.expansum單獨處理的組織，而GABA單獨處理后防御基因表達沒有發(fā)生上調(diào)，這在分子水平上進一步解釋了GABA能通過調(diào)控梨果

10、實抗性基因表達而誘導果實抗性和可能存在Priming機制。
　　2.5、GABA對梨果實體內(nèi)抗性物質(zhì)代謝和GABA支路代謝的影響
　　利用GC-MS檢測GABA、P.expansum單獨或聯(lián)合處理梨果實傷口后的物質(zhì)代謝，結(jié)果表明在GABA與P.expansum聯(lián)合處理的果實組織中，肉桂酸和香豆素含量均顯著高于對照組、GABA、或P.expansum單獨處理組的含量。這與通過生理生化分析和基因表達分析得到的GABA與P.exp

11、ansum聯(lián)合處理能顯著誘導果實組織PpPAL基因表達，調(diào)控PAL活性升高的結(jié)果一致。因此PAL代謝可能與GABA誘導梨果實抗性的機理密切相關(guān)。
　　此外，在P.expansum的生物脅迫下，GABA處理還顯著激發(fā)了GABA的代謝途徑:在GABA與P.expansum聯(lián)合處理的果實中琥珀酸、谷氨酸鹽和腐胺含量均顯著高于對照組、GABA或P.expansum單獨處理組，并發(fā)現(xiàn)延胡索酸生成，而在其他三種處理后的果實中沒有檢測到;同時也