纖維蛋白凝膠用于兔角膜緣上皮細(xì)胞移植培養(yǎng)的研究.pdf

1、第一部分構(gòu)建兔全角膜緣干細(xì)胞缺乏模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　【目的】研究成功構(gòu)建兔全角膜緣干細(xì)胞缺乏模型的方法和時(shí)間,觀察造模后各時(shí)間點(diǎn)模型眼角膜的病理結(jié)構(gòu)。
　　【方法】用手術(shù)刀360°切除角膜緣內(nèi)1mm外2mm厚約100～150μm的上皮組織和剩余的全部中央角膜上皮組織及其淺層基質(zhì),以角膜混濁、角膜新生血管和角膜上皮熒光素鈉染色為觀察指標(biāo),分別統(tǒng)計(jì)術(shù)后第2～5周時(shí)的模型得分,并將各時(shí)期成功模型眼標(biāo)本進(jìn)行HE染色、PAS染色和間接

2、免疫熒光染色。
　　【結(jié)果】術(shù)后第2～5周時(shí)的模型成功率分別為12.5％、62.5%、81.3%和87.5%,卡方檢驗(yàn)結(jié)果示術(shù)后第3周造模成功率明顯高于第2周,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Χ2=8.533,P=0.003),而第3周與第4周相比、第4周與第5周相比、第3周與第5周相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模成功的平均時(shí)間是3.21±0.80周。成功模型眼的典型外觀可見(jiàn)角膜明顯混濁、角膜新生血管和熒光素鈉染色陽(yáng)性。病理切片HE染色示角膜基質(zhì)

3、水腫、較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管。PAS染色僅在第5周時(shí)可見(jiàn)杯狀細(xì)胞。造模成功的模型眼角膜在各時(shí)間點(diǎn)CK3染色均為陰性。
　　【結(jié)論】手術(shù)切除角膜緣及全部中央角膜上皮和淺層基質(zhì)可以成功構(gòu)建全角膜緣干細(xì)胞缺乏的動(dòng)物模型,模型成功的平均時(shí)間為3.2周。
　　第二部分以纖維蛋白凝膠為載體培養(yǎng)兔角膜緣干細(xì)胞的研究
　　【目的】研究兔角膜緣干細(xì)胞在纖維蛋白凝膠上的最佳接種方式及其生長(zhǎng)情況。
　　【方法】取角膜緣上皮組織塊進(jìn)

4、行細(xì)胞培養(yǎng),MTT法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)活性,并用針對(duì)抗角蛋白3(CK3)的單克隆抗體AE5和抗增殖性細(xì)胞核抗原單克隆抗體(PCNA)進(jìn)行間接免疫熒光法來(lái)鑒定角膜緣干細(xì)胞。將傳第二代的細(xì)胞分A、B兩組分別接種到纖維蛋白凝膠表面和凝膠體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),在接種后第5天、10天和15天時(shí)將凝膠溶解離心后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目,比較兩種接種方式下細(xì)胞的增殖力。
　　【結(jié)果】兔角膜緣干細(xì)胞傳第一代時(shí)在接種后第三天細(xì)胞增殖活性最強(qiáng),間接免疫熒光染色:CK3染色胞漿