TAM-Gas6通路在石英粉塵致肺部炎性和纖維化反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、石英粉塵的長期暴露會導(dǎo)致肺部炎性反應(yīng)及彌漫性纖維化，這與石英粉塵引起的機(jī)體免疫失衡相關(guān)。TAM受體家族（包括Tyro3、Axl和Mer三種受體）與其配體生長停滯特異性蛋白6（Growth Arrest Specific protein6, Gas6）組成TAM/Gas6通路，對機(jī)體免疫反應(yīng)有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。本研究擬結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群研究，探討TAM/Gas6通路在石英粉塵致肺炎性及纖維化反應(yīng)中的作用。
　　第一部分 TAM/Gas6

2、通路在石英粉塵所致小鼠肺部炎性反應(yīng)中的作用
　　目的：探究TAM/Gas6通路在石英粉塵所致小鼠肺部炎性反應(yīng)中的作用。
　　方法：通過氣管滴注的方法制作小鼠肺部暴露模型，共分為8組：①生理鹽水對照組，滴注無菌生理鹽水；②石英粉塵暴露組，滴注石英粉塵懸液；③非特異性抗體組，滴注石英粉塵懸液及非特異性抗體；④Tyro3、Axl或Mer阻斷組，滴注石英粉塵懸液及Tyro3、Axl或 Mer的特異性抗體；⑤Gas6補(bǔ)充組或阻斷組，滴

3、注石英粉塵懸及重組小鼠Gas6蛋白（recombinant murine Gas6, rmGas6）或Gas6的特異性抗體。滴注操作后小鼠定期腹腔注射相應(yīng)抗體或蛋白，于第7、28和84天處死。提取左肺制作病理切片，免疫組化和H&E染色后觀察不同組肺組織TAM/Gas6激活水平、炎性浸潤情況并進(jìn)行評分。收集小鼠肺泡灌洗液，測定、比較其中乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）和總蛋白（Total Protein,

4、 TP）、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞介素（Interleukin, IL）-1β和腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）-α水平。
　　結(jié)果：免疫組化結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，石英粉塵暴露組小鼠肺組織中磷酸化TAM受體水平升高。與各時(shí)點(diǎn)石英暴露組或非特異性抗體組比較，阻斷Tyro3、Axl、Mer或Gas6后小鼠肺泡灌洗液中LDH及TP、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-1β及TNF-α水平、切

5、片炎性反應(yīng)評分顯著增高（P<0.05或P<0.01）。補(bǔ)充rmGas6后，以上炎性指標(biāo)顯著下降（P<0.05或P<0.01）。橫向比較TAM受體三個(gè)阻斷組小鼠肺部炎性反應(yīng)增強(qiáng)程度，以Mer阻斷組最為顯著。
　　結(jié)論：石英粉塵的暴露會導(dǎo)致小鼠肺組織 TAM/Gas6通路激活程度升高。TAM/Gas6通路，尤其是 Mer受體，可能在石英粉塵導(dǎo)致的肺部炎性反應(yīng)起重要的負(fù)性調(diào)控作用。
　　第二部分 TAM/Gas6通路在石英粉塵所致

6、小鼠肺部纖維化病變中的作用
　　目的：探究TAM/Gas6通路在石英粉塵所致小鼠肺部纖維化病變中的作用。
　　方法：通過氣管滴注方法制作小鼠暴露模型，具體方法及分組同第一部分。氣管滴注后第7、28和84天分別處死各組小鼠，通過RT-PCR法測定肺組織中纖連蛋白和膠原蛋白Ⅰ的mRNA表達(dá)水平，通過蛋白質(zhì)印跡法測定其蛋白表達(dá)水平。提取小鼠左肺制作病理切片，Masson染色后鏡下觀察其纖維化水平并評分。
　　結(jié)果：氣管滴注后

7、第84天，與石英暴露組或非特異性抗體組比較，Tyro3、Axl、Mer及Gas6阻斷組小鼠肺組織纖連蛋白和膠原蛋白Ⅰ的mRNA及蛋白水平、Masson染色后纖維化評分均顯著升高（P<0.05或 P<0.01）；而 Gas6補(bǔ)充組小鼠的以上各纖維化反應(yīng)指標(biāo)顯著降低（P<0.05或P<0.01）。
　　結(jié)論：TAM/Gas6通路可能對石英粉塵導(dǎo)致的肺部纖維化病變起負(fù)性調(diào)控作用。
　　第三部分矽肺病例-對照人群外周血中 TAM/G

8、as6的表達(dá)水平及作用探討
　　目的：通過病例-對照研究，探討機(jī)體外周血中TAM/Gas6的表達(dá)與矽肺發(fā)病或進(jìn)展危險(xiǎn)性間的關(guān)系。
　　方法：本研究納入對象均來自湖北省黃石地區(qū)某礦區(qū)。病例組為50名男性矽肺患者（包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者19人、21人和10人）。對照組為48名有石英粉塵暴露史的健康男性（接塵對照組）和49名無接塵史健康男性（非接塵對照組）。不同組別人群年齡、體重指數(shù)、吸煙及飲酒狀況匹配。采集研究對象空腹外周血，通過

9、RT-PCR法測定外周血白細(xì)胞中TAM/Gas6的mRNA表達(dá)水平；通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定血漿中Gas6蛋白的表達(dá)水平。采用多元Logistic回歸分析外周血TAM/Gas6表達(dá)水平與矽肺患病及進(jìn)展危險(xiǎn)性間的關(guān)系。
　　結(jié)果：與非接塵對照組比較，接塵組與矽肺組外周血白細(xì)胞中 Tyro3及 Axl mRNA水平顯著升高（P<0.01）；而外周血白細(xì)胞中 Gas6 mRNA水平顯著降低（P<0.05）。多元Logistic回歸分析發(fā)

10、現(xiàn)，機(jī)體外周血白細(xì)胞Tyro3和Axl mRNA水平的增高及 Gas6 mRNA水平的降低與矽肺的患病存在關(guān)聯(lián)[Tyro3-mRNA OR=5.13(2.65-9.95);Axl-mRNA OR=1.90(1.01-3.58);Gas6-mRNA OR=0.19(0.10-0.37)]。Ⅲ期矽肺患者Gas6的mRNA表達(dá)水平較Ⅰ期、Ⅱ患者顯著降低（P<0.05）；但多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)TAM/Gas6表達(dá)水平的變化與矽肺期別

11、進(jìn)展危險(xiǎn)性間無顯著關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)論：機(jī)體外周血白細(xì)胞中Tyro3及Axl mRNA水平的升高或Gas6 mRNA的降低與矽肺患病危險(xiǎn)性之間可能存在關(guān)聯(lián)。
　　本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新之處包括：（1）首次通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討了TAM/Gas6通路在石英粉塵引起的肺部炎性及纖維化反應(yīng)中的負(fù)性調(diào)控作用，深入了對石英粉塵所致肺部病變相關(guān)機(jī)制的理解；（2）通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)研究了TAM三種受體（即Tyro3、Axl和 Mer受體）在石英粉塵致肺部

12、炎性及纖維化過程中的作用，發(fā)現(xiàn)三者均能對相關(guān)病變起到負(fù)性調(diào)控功能，且以 Mer的作用最為明顯，避免了既往研究只研究一種受體的局限性；（3）結(jié)合動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)研究兩種研究方法，均證實(shí)TAM/Gas6通路與矽肺的發(fā)生、發(fā)展間存在關(guān)聯(lián)。
　　本研究的不足之處主要有：（1）人群研究只測定了人群外周血中TAM/Gas6的表達(dá)水平，而人體肺部（如矽肺病人肺泡灌洗液或支氣管活檢組織等） TAM/Gas6的表達(dá)水平仍需進(jìn)一步測定；（2