Thy-1DNA甲基化在煤塵致肺纖維化中的作用研究.pdf

1、目的：采用體外實(shí)驗(yàn)方法，通過間接培養(yǎng)方式，分別觀察煤塵、矽塵通過THP-1單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞致人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）中纖維化相關(guān)基因COL-I、COL-III、α-SMA表達(dá)變化，Thy-1mRNA表達(dá)及其DNA甲基化的變化、DNA甲基化相關(guān)基因DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)變化，觀察煤塵、矽塵致人胚肺成纖維細(xì)胞纖維化改變中Thy-1是否發(fā)生DNA甲基化。
　　方法：采用四唑鹽2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-

2、3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8）比色法確定煤塵液和矽塵工作液分別染毒單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞濃度；用含500nmol/L佛波酯（PMA）的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞，24h誘導(dǎo)分化后成單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞，分別收集100μg/mL煤塵工作液染毒巨噬細(xì)胞24h的培養(yǎng)上清液和100μg/mL矽塵工作液染毒后培養(yǎng)上清液，進(jìn)而刺激人胚肺成纖維細(xì)胞24h、48h、72h，分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1.酶聯(lián)免疫

3、分析（ELISA）法測(cè)定巨噬細(xì)胞中IL-6、TGF-β1蛋白含量和人胚肺成纖維細(xì)胞中TGF-β1、COL-I、COL-III、α-SMA蛋白含量；2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)人胚肺成纖維細(xì)胞中COL-I、COL-III、α-SMA、Thy-1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表達(dá)；3.巢式降落式甲基化特異性PCR（nM-PCR）法檢測(cè)Thy-1DNA甲基化。
　　結(jié)果：（1）不同濃度煤塵、矽塵工作液（0、25、5

4、0、100、150、200μg/mL）染毒單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞，在150、200μg/mL劑量組與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖活性明顯降低，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，差異有顯著性（P﹤0.05）。（2）煤塵、矽塵工作液（100μg/mL）染毒巨噬細(xì)胞后，IL-6、TGF-β1表達(dá)升高，與對(duì)照組比較，有顯著性差異（P﹤0.05）。（3）煤塵、矽塵工作液染毒巨噬細(xì)胞后上清液刺激人胚肺成纖維細(xì)胞24h，48h和72h，TGF-β1、COL-I、COL-III

5、、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，并且隨著染毒時(shí)間增加，表達(dá)逐漸升高，呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系（p<0.05）。（4）煤塵、矽塵工作液染毒巨噬細(xì)胞后上清液刺激人胚肺成纖維細(xì)胞24h，48h和72h Thy-1mRNA表達(dá)逐漸降低，呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系（P﹤0.05）。（5）煤塵、矽塵工作液染毒巨噬細(xì)胞后上清液刺激人胚肺成纖維細(xì)胞24h，48h和72h Thy-1DNA甲基化水平逐漸升高，與對(duì)照組比較，有顯著性意義（P﹤0.05）。（

6、6）煤塵、矽塵工作液染毒巨噬細(xì)胞后上清液刺激人胚肺成纖維細(xì)胞24h，48h和72hDNMT1、3a、3b表達(dá)逐漸升高（P﹤0.05），其中煤塵組24h DNMT3a，矽塵組48h DNMT3b mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較降低，無顯著性意義。
　　結(jié)論：（1）煤塵、矽塵可促使巨噬細(xì)胞中IL-6和TGF-β1表達(dá)升高，發(fā)生炎性改變。
　　（2）通過間接培養(yǎng)方式，巨噬細(xì)胞上清中炎性因子的作用下導(dǎo)致MRC-5細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)異常