Notch信號(hào)通路在腹膜透析相關(guān)的大鼠腹膜纖維化中的作用研究.pdf

1、腹膜透析治療終末期腎臟疾病已有30余年的歷史，現(xiàn)在已經(jīng)有越來(lái)越多終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)患者接受腹膜透析治療。與血液透析相比，透析的前1-2年內(nèi)在總體生存率方面腹膜透析是占優(yōu)勢(shì)的，但是隨著透析時(shí)間的延長(zhǎng)，大約50％的病人因?yàn)槌瑸V衰竭在4-5年內(nèi)退出腹膜透析。目前的研究表明，隨著插管技術(shù)的改進(jìn)，感染率的下降，腹膜纖維化導(dǎo)致的超濾功能喪失已經(jīng)成為長(zhǎng)期腹膜透析患者退出的主要原因。
　　

2、腹膜是一種生理性的半透膜，表面覆蓋著一層扁平的腹膜間皮細(xì)胞，間皮細(xì)胞下有結(jié)締組織、少數(shù)成纖維細(xì)胞和豐富的毛細(xì)血管。以往認(rèn)為固有的間質(zhì)成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞是造成腹膜纖維化的主要細(xì)胞，而間皮細(xì)胞僅僅是腹膜損傷的受害者，但是近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。轉(zhuǎn)分化的間皮細(xì)胞具有肌成纖維母細(xì)胞的特性，其遷移能力和侵襲性顯著增強(qiáng).并且分泌VEGF，從而在腹膜纖維化及血管增生中發(fā)揮作用。因

3、此，腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是腹膜透析患者腹膜功能逐漸降低的關(guān)鍵因素之一。
　　 Notch信號(hào)通路是一條保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，廣泛表達(dá)于從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物等多個(gè)物種。Notch信號(hào)通路由受體、配體和DNA結(jié)合蛋白3部分構(gòu)成。相鄰細(xì)胞上的受體和配體結(jié)合后導(dǎo)致受體構(gòu)象改變暴露出蛋白水解酶的酶切位點(diǎn)，并經(jīng)隨后2次蛋白水解作用釋放出具有核定位信號(hào)的胞內(nèi)段(Notchintracellular domain，NICD)，從而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)

4、，激活下游靶基因，參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。在上述Notch信號(hào)通路的活化過(guò)程中，受體的最后一步蛋白水解作用至關(guān)重要，在γ-分泌酶(γ-Secretase)的作用下直接釋放出具有活性的NICD。實(shí)驗(yàn)證實(shí)γ-分泌酶抑制劑(γ-Secretase Inhibitor，GSI)可以通過(guò)其特異性的抑制γ-分泌酶的作用，減少NICD的釋放，從而抑制Notch通路的活化。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路4種同源受體：Notchl-4，

5、5種同源配體：Delta-1、Delta-3、Delta-4、Jagged-1、Jagged-2和兩類下游靶基因：Hes和Hey家族。
　　 研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路與神經(jīng)干細(xì)胞、肺、胰腺、腎、軟骨以及前列腺的分化發(fā)育密切相關(guān)。近年來(lái)的研究更發(fā)現(xiàn)異?；罨腘otch信號(hào)作為敏癌因素或抑癌因素與多個(gè)系統(tǒng)的腫瘤發(fā)生相關(guān)。隨著研究的深入，進(jìn)一步證實(shí)Notch信號(hào)通路在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用與其觸發(fā)EMT有

6、關(guān)。但是，在腹膜組織中是否存在Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，Notch信號(hào)通路是否也在腹膜問(wèn)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程發(fā)揮作用？尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)的目的是闡明Notch信號(hào)通路在腹膜纖維化中的作用和機(jī)制，探討抑制Notch信號(hào)活化對(duì)腹膜纖維化進(jìn)程的影響，為腹膜透析相關(guān)的腹膜纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 第一部分 觀察Notch信號(hào)通路在高濃度葡萄糖腹膜透析液所致大鼠腹膜纖維化模型中的變化
　　 一、目的：
　　

7、 構(gòu)建大鼠腹膜纖維化模型，觀察在大鼠腹膜纖維化過(guò)程中Notch信號(hào)通路的變化。
　　 二、方法：
　　 18只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、2周模型組和4周模型組，2周和4周模型組每同腹腔注射4.25％葡萄糖透析液100ml/kg，并分別于連續(xù)注射14天和28天后殺檢大鼠，行腹膜平衡實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確量取腹腔內(nèi)流出液體，留取0、4小時(shí)血清和腹腔流出液標(biāo)本，計(jì)算葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量，并分別留取壁層和臟層腹膜組織。HE和Mas

8、son染色觀察壁層腹膜病理變化；超濾量和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量反映腹膜功能；Western blot檢測(cè)臟層腹膜組織中α-SMA、E-cadherin和Collagen I的蛋白表達(dá)的變化；同時(shí)采用Western blot檢測(cè)臟層腹膜組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)；使用RT-PCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路的各種受體、配體及下游靶基因的mRNA在臟層腹膜組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步使用Western blot和組織間接免疫熒光的方法觀察臟層腹膜組織中No

9、tch信號(hào)通路配體Jagged-1、Notch信號(hào)通路受體Notch-1以及Notch信號(hào)通路的下游靶基因Hes-1的蛋白水平的變化。采用Western blot檢測(cè)Notch信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子Numb的蛋白水平的變化。
　　 三、結(jié)果：
　　 四、小結(jié)：
　　 1、高濃度葡萄糖透析液可以導(dǎo)致大鼠腹膜纖維化，并且上調(diào)腹膜組織中TGF-β1的表達(dá)：
　　 2、在大鼠腹膜纖維化模型中存在Notch信號(hào)通路

10、的活化；
　　 3、Notch信號(hào)通路的活化可能與腹膜纖維化模型中TGF-β1的高表達(dá)有關(guān)。
　　 第二部分 Notch信號(hào)通路在TGF-β1誘導(dǎo)原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用
　　 第一章、觀察Notch信號(hào)通路在TGF-β1誘導(dǎo)原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的變化
　　 目的：
　　 通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，觀察Notch信號(hào)通路在其轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的變化。
　　

11、 方法：
　　 分離培養(yǎng)原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞，取第二到第四代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究，于TGF-β1不同濃度(1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)作用48小時(shí)后及TGF-β110ng/ml作用不同時(shí)間點(diǎn)(24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))收集細(xì)胞，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中α-SMA、Collagen I和VEGF蛋白的表達(dá)，并用Westernblot檢測(cè)Notch信號(hào)通路的配體Jagged-

12、1、Notch信號(hào)通路的受體Notch-1和Notch信號(hào)通路的下游靶基因Hes-1的蛋白水平的變化。使用Western blot檢測(cè)Notch信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子Numb在TGF-β110ng/ml作用不同時(shí)間點(diǎn)(24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))的蛋白表達(dá)的變化。
　　 三、結(jié)果：
　　 四、小結(jié)：
　　 1、TGF-β1以劑量和時(shí)間依賴的模式誘導(dǎo)原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化；
　　 2、TGF-β1

13、誘導(dǎo)原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的活化。
　　 第二章、抑制Notch信號(hào)通路活化對(duì)原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響
　　 一、目的：
　　 使用GSI特異性的阻斷Notch信號(hào)通路，觀察抑制Notch信號(hào)通路活化對(duì)原代大鼠腹膜問(wèn)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。
　　 二、方法：
　　 三、結(jié)果：
　　 Western blot顯示與TGF-β1刺激組相比，GSI可以有效且特異的抑制TGF

14、-β1+GSI處理組中Notch信號(hào)通路的活化，表現(xiàn)為細(xì)胞中Jagged-1、Notch-1和Hes-1蛋白表達(dá)的明顯降低(均p≤0.05)。與此同時(shí)，TGF-β1+GSI處理組的α-SMA、Collagen I和VEGF的蛋白表達(dá)雖然比正常對(duì)照組有所升高但比TGF-β1刺激組明顯降低(均p≤0.05)。
　　 四、小結(jié)：
　　 1、GSI可以有效抑制原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的活化；
　　 2、特

15、異性的阻斷Notch信號(hào)通路的活化可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。
　　 第三部分 抑制Notch信號(hào)通路的活化對(duì)高濃度葡萄糖腹膜透析液所致大鼠腹膜纖維化的影響
　　 一、目的：
　　 通過(guò)在高濃度葡萄糖透析液加用GSI以特異性的阻斷Notch信號(hào)通路的辦法，觀察抑制Notch信號(hào)通路對(duì)高濃度葡萄糖引起的透析相關(guān)性腹膜纖維化的治療作用。
　　 二、方法：
　　 24只清潔級(jí)

16、健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、4周模型組(每日腹腔注射4.25％腹膜透析液100ml/kg)、溶媒對(duì)照組(每日腹腔注射含0.2％DMSO的4.25％腹膜透析液100ml/kg)和GSI治療組(每日腹腔注射含10μMγ-SecretaseInhibitor IX的4.25％腹膜透析液)，4組大鼠均于第28天殺檢，行腹膜平衡實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確量取腹腔內(nèi)流出液體，留取0、4小時(shí)血清和腹腔流出液標(biāo)本，計(jì)算葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量，并分別留取壁層和臟層腹膜組織

17、。HE和Masson染色觀察壁層腹膜病理變化；超濾量和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量反映腹膜功能；Western blot檢測(cè)臟層腹膜組織中Notch信號(hào)通路的配體Jagged-1、Notch信號(hào)通路受體Notch-1及Notch信號(hào)通路的下游靶基因Hes-1的蛋白水平的變化；使用Western blot和組織間接免疫熒光兩種方法觀察腹膜組織中α-SMA、Collagen I和VEGF蛋白表達(dá)的變化。
　　 三、結(jié)果：
　　 四、小結(jié)：<

18、br>　　 在高濃度葡萄糖腹膜透析液所致大鼠腹膜纖維化模型中特異性的阻斷Notch信號(hào)通路可以有效的延緩大鼠腹膜纖維化的進(jìn)程，保護(hù)腹膜功能。
　　 全文總結(jié)：
　　 1.高濃度葡萄糖透析液所致大鼠腹膜纖維化模型中存在Notch信號(hào)通路的活化，該通路的活化可能與TGF-β1高表達(dá)有關(guān)；
　　 2.TGF-β1誘導(dǎo)原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化的過(guò)程中伴有Notch信號(hào)通路的活化；
　　 3.特異性的阻斷N