鼠抗人PD-L1單克隆抗體的研制及其生物學功能的研究.pdf

1、Bretscher和Cohn在T細胞活化雙信號模型的基礎上提出“協(xié)同刺激信號”，即T細胞的活化除了需要通過APC遞呈MHC-抗原肽給抗原特異性T細胞提供第一信號外，還需要一系列協(xié)同刺激分子提供第二信號，才能使T細胞達到生理活化閾值產(chǎn)生正常的免疫應答。如果缺少共刺激分子提供的第二信號，將會導致T細胞的無反應性或特異性免疫耐受甚至凋亡。正性和負性協(xié)同刺激信號的調(diào)節(jié)及兩者之間的平衡在機體免疫應答的整個過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。 共刺激

2、分子分為TNF／TNFR和B7／CD28兩大超家族。近幾年，B7家族成員不斷擴大，其中PD-L1是新近發(fā)現(xiàn)的共刺激分子之一。PD-L1具有IgV和IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)，具有廣泛的組織表達譜，甚至在一些腫瘤細胞株上也有較高表達。PD．1是PD-L1的一個抑制性受體，主要表達在活化的T細胞上，PD-1／PD-L1途徑在抑制T細胞增殖的同時，也影響很多細胞因子的分泌。同時，PD-L1在腫瘤細胞上的高表達，能減弱機體抗腫瘤免疫應答的作用，

3、可能與腫瘤的免疫逃避機制密切相關，阻斷此途徑可增強機體的抗腫瘤免疫應答。大量研究顯示PD-L1在機體免疫應答的調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用，PD-L1可能會成為腫瘤治療中新的靶分子。更為重要的是，目前關于PD-L1對T細胞的生物學作用，不同的研究小組報道了截然不同的結(jié)果，一些研究表明，PD-L1還能作用T細胞促進其顯著增殖和IL-2的分泌，具體機制尚不明了。 本研究課題首先利用天然高表達PD-L1的人乳腺癌細胞株MDA-MB-23l

4、細胞為免疫原免疫BALB~小鼠，采用B淋巴細胞融合技術，將反復免疫后的小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2／0進行細胞融合，以轉(zhuǎn)基因細胞L929／PD-L1作為陽性篩選細胞，以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的對照細胞L929／mock作為陰性對照細胞，經(jīng)免疫熒光標記分析及抗體分泌陽性雜交瘤細胞的反復篩選，并經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得l株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為10E10。經(jīng)快速定性試紙法分析鑒定，10E10的重鏈為IgGl

5、；而輕鏈為K，可用于Western-blot和免疫組織化學分析。雜交瘤細胞株體外連續(xù)傳代(40代)培養(yǎng)，液氮凍存半年后復蘇，仍生長良好，穩(wěn)定分泌抗體。 運用成功制備的單抗，我們探討了PD-L1信號對人外周血T細胞和Mo-DC的生物學行為的影響。單抗10E10能阻斷PD．1一PD-L1通路，通過下調(diào)負性信號的作用，在體外刺激T細胞的增殖，同樣能夠促進雙向混合淋巴細胞反應，由此證實所獲的抗人PD-L1單抗10E10為阻斷型功能抗體。

6、單抗10E10能結(jié)合體外誘導的Mo-DC上表達的PD-L1分子，并通過逆向信號抑制DC的成熟，表現(xiàn)為下調(diào)DC表面的正性共刺激分子的表達以及提高DC的抗原吞噬能力。腫瘤細胞的體外實驗表明，單抗10E10通過阻斷腫瘤細胞上表達的PD-L1分子與活化T細胞上相應受體之間的相互作用，進而抑制活化T細胞的凋亡，提高其對腫瘤細胞的殺傷效應。 單抗10E10和本室已有的一株抗PD-L1單抗2H11識別不同的抗原位點。以2H1l為包被抗體、Bi

7、o—10ElO為檢測抗體，成功建立了可溶性PD-L1蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。以此方法檢測細胞裂解液中的PD-L1蛋白和商品化PD-L1標準蛋白，所繪制的工作曲線均有良好的線性關系。 綜上所述，本研究成功制備了一株特異性鼠抗人PD-L1功能型單克隆抗體，并初步探討了PD一1．PD-Ll共信號對人外周血T細胞和Mo-DC的生物學效應，及其在腫瘤免疫逃逸中的作用，證實了PD-L1信號在免疫應答的不同階段和不同的免疫微環(huán)境中發(fā)揮的不同