月見(jiàn)草素B納米乳液體系的構(gòu)建及其控釋機(jī)理研究.pdf

1、課題組的前期研究已嘗試?yán)檬称芳?jí)生物活性肽——酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPP）與活性多糖——?dú)ぞ厶牵–hitosan，CS）構(gòu)建活性物載體體系，系統(tǒng)研究了兩者相互作用關(guān)系，并明確構(gòu)建條件和步驟。本研究在前期研究基礎(chǔ)上利用該載體體系包埋一種天然抗氧化、抗炎、抗腫瘤的活性大環(huán)二聚體鞣質(zhì)——月見(jiàn)草素B（Oenothein B，OeB）。由于OeB是具有酯鍵及大量羥基的大環(huán)二聚體鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)，它的加入也會(huì)影響酪蛋

2、白磷酸肽-殼聚糖載體體系的構(gòu)建，因此，本論文從研究三者相互作用出發(fā)，進(jìn)一步指導(dǎo) OeB納米載體小球的構(gòu)建條件、方式，從而實(shí)現(xiàn)OeB的有效包埋。同時(shí)，優(yōu)化了適合大規(guī)模生產(chǎn)的制備方法，對(duì)制備納米小球的穩(wěn)定性、緩釋作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。最后研究了納米小球在 Caco-2細(xì)胞模型中吸收機(jī)制。研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　?。?）CPP/CS/OeB相互作用研究。通過(guò)改變CPP/CS/OeB三者比例、體系濃度，觀(guān)察三者相互作用現(xiàn)象，采集粒徑（Partic

3、leSize）、光強(qiáng)（CountRate）、多分散性系數(shù)（Polydispersity）、濁度（Turbidity）等表征參數(shù)，繪制出三者相圖，總結(jié)規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，在只有CS和OeB的體系中，隨OeB與CS質(zhì)量比值的增大，體系經(jīng)歷溶液-溶膠-絮凝沉淀（Solution-Sol-Flocculation）轉(zhuǎn)變，但在物質(zhì)總濃度低于0.9 mg/mL時(shí)，兩者相互作用現(xiàn)象不明顯。在只有CPP和CS的體系中，體系隨CPP與CS質(zhì)量比值的增大經(jīng)歷溶

4、液-聚電解質(zhì)小球-顆粒狀沉淀（Solution-Complex Coacervate-Precipitation）轉(zhuǎn)變，該轉(zhuǎn)變過(guò)程在很小的濁度下就可以發(fā)現(xiàn)；當(dāng)兩者比例不變時(shí)，隨總濃度上升，參數(shù)粒徑、光強(qiáng)值、濁度均呈上升趨勢(shì)。在只有CPP和OeB的體系中，無(wú)論濃度高低，體系保持澄清透明狀態(tài)。在CPP/CS/OeB體系中，存在四種狀態(tài)：①溶液（Solution）、②聚電解質(zhì)小球（Complex Coacervate）、③絮凝沉淀（Flocc

5、ulation）、④顆粒狀沉淀（Precipitation）。以四種狀態(tài)為區(qū)域劃分依據(jù)，在三角形坐標(biāo)圖中，繪制CPP/CS/OeB相圖。對(duì)比CPP/CS/OeB相圖發(fā)現(xiàn)，影響CPP/CS/OeB狀態(tài)的主要因素為三者比例，濃度次之。以相圖作為指導(dǎo)，從CPP/OeB/CS共同作用所形成聚合物的粒徑、數(shù)量、體系穩(wěn)定性等方面綜合考慮，選擇體系終濃度為1.4 mg/mL，CPP/CS/OeB三者比例為3:3:1的條件制備聚電解質(zhì)納米小球，此時(shí)納米

6、小球粒徑為156.1±2.2 nm，帶電量22.02±1.3mV，光強(qiáng)652.1±kcps、多分散性系數(shù)0.214。
　　（2）OeB納米小球制備工藝的優(yōu)化。工藝流程為交聯(lián)、離心、超聲、真空冷凍干燥四個(gè)步驟。首先，本實(shí)驗(yàn)以粒徑、光強(qiáng)、包封率、載藥量為指標(biāo)，研究了天然交聯(lián)劑京尼平的添加量、作用時(shí)間對(duì)京尼平交聯(lián)的OeB納米小球（OeB-GNP）的固化效果的影響；其次，以上清液和納米小球富集液的粒徑、光強(qiáng)為指標(biāo)，研究了離心力、離心時(shí)間對(duì)

7、其分離、富集效果的影響；再者，以分析多分散性系數(shù)、粒徑、光強(qiáng)、濁度為指標(biāo)，研究了超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)OeB-GNP的分散效果的影響；最后，以粒徑及其分布為指標(biāo)，利用掃描電鏡圖，研究真空冷凍干燥工藝對(duì)OeB-GNP形狀的影響。結(jié)果表明，OeB-GNP的最佳工藝為：京尼平體系濃度為0.4 mg/mL，交聯(lián)時(shí)間12h；離心條件為13400g，30min；超聲條件為100W，45min。工藝優(yōu)化后所得OeB-GNP參數(shù)為：粒徑范圍170~290

8、 nm，CountRate范圍為500~700 kcps，帶電量18.06±1.8 mV，多擴(kuò)散系數(shù)0.200±0.05，OeB包封率為99％，載藥量為15%。
　?。?）OeB-GNP控釋效果及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。以O(shè)eB的保留率和納米小球中OeB釋放率為指標(biāo)，研究pH、溫度、時(shí)間、人工模擬胃腸液、消化酶液環(huán)境的變化對(duì)OeB穩(wěn)定性和OeB-GNP控釋效果的影響；其次，以粒徑、光強(qiáng)、多分散性系數(shù)、濁度為指標(biāo)，研究了 pH、溫度、貯存時(shí)間、

9、溶液環(huán)境的變化對(duì)納米小球性狀的影響；最后，以熒光值為指標(biāo)，使用多功能酶標(biāo)儀和熒光倒置顯微鏡分析OeB-GNP清除活性的能力。結(jié)果表明，在pH1.2~7.0、溫度4~25℃條件下以及不同溶液環(huán)境中交聯(lián)納米小球性狀穩(wěn)定。在人工模擬胃腸液和兩種消化酶液中，交聯(lián)納米小球中OeB釋放率隨時(shí)間的變化而不同，均在10%以?xún)?nèi)，其中，在人工模擬胃液中釋放率最低，為0.2%~0.6%，在人工模擬胃液中釋放率最高，為0.4%~9.6%，被包埋的OeB得以緩釋

10、和保護(hù)，相反，空白對(duì)照未包埋的OeB穩(wěn)定性差。細(xì)胞抗氧化能力研究方面顯示，OeB-GNP具有一定的抗氧化活性，并呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，但效果不如未包埋的OeB。當(dāng)CAA值達(dá)到50時(shí)，OeB-GNP中OeB的質(zhì)量濃度為0.117 mg/mL，而未包埋的OeB質(zhì)量濃度為0.024 mg/mL。
　?。?） OeB-GNP吸收效果的評(píng)價(jià)。本文成功地建立 Caco-2細(xì)胞模型，并考察OeB-GNP在Caco-2單層細(xì)胞的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)特征

11、，評(píng)價(jià)其在腸道的吸收效果。利用倒置熒光顯微鏡觀(guān)Caco-2細(xì)胞攝取效果，發(fā)現(xiàn)OeB-GNP能很好地附著在Caco-2細(xì)胞表面。利用采用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)OeB和OeB-GNP轉(zhuǎn)運(yùn)后BL側(cè)OeB的轉(zhuǎn)運(yùn)量，均未能檢測(cè)到OeB。但利用動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)OeB-GNP轉(zhuǎn)運(yùn)后BL側(cè)的表征參數(shù)，發(fā)現(xiàn)隨轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的延長(zhǎng)和轉(zhuǎn)運(yùn)濃度的增大，BL側(cè)樣液的CountRate值增大，粒徑分布主要范圍在80~105 nm，表明OeB-GNP能以整體形式透