大鼠肝細(xì)胞核的肝再生相關(guān)蛋白鑒定與作用分析.pdf

1、肝臟具有很強(qiáng)的再生能力，大鼠部分肝切除（paritalhepatectomy，PH）作為刺激信號(hào)，通過多種途徑激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)殘肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)，補(bǔ)償丟失的肝臟細(xì)胞并恢復(fù)肝臟的生理功能，這個(gè)過程涉及包括核蛋白在內(nèi)的多種功能蛋白參與。細(xì)胞核是遺傳和代謝的調(diào)控中心，核內(nèi)含有較多的功能蛋白質(zhì)，從蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究它們與大鼠肝再生中的相關(guān)性有助于揭示肝再生的分子機(jī)制。
　　 為此，本研究首先用兩步灌流結(jié)合Percoll密

2、度梯度離心分離純化大鼠肝細(xì)胞，用蔗糖密度梯度離心得到純的肝細(xì)胞核，提取細(xì)胞核蛋白進(jìn)行雙向電泳(2D)結(jié)合灰度掃描進(jìn)行定量分析，用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜進(jìn)行定性分析。在大鼠肝細(xì)胞核中鑒定出了204種核蛋白，包括持家蛋白、低峰度的轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)應(yīng)答分子等。本研究進(jìn)而制備了大鼠2/3部分肝切除模型，并分別在肝再生的0h、2h、6h、12h、24h、30h、36h、72h、120h、168h取材;采用上述策略構(gòu)建肝再生(liverrege

3、neration，LR)進(jìn)程中核蛋白的表達(dá)譜，以相對(duì)0h表達(dá)變化2倍為界限，確定大鼠肝再生的相關(guān)核蛋白，用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定其具體成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，62種蛋白在肝再生進(jìn)程中發(fā)生了有意義表達(dá)變化，其中49種表達(dá)上調(diào)，12種蛋白表達(dá)下調(diào)，1種蛋白表達(dá)上下調(diào)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室研究得到的大鼠肝再生相關(guān)基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，分析基因水平和蛋白水平表達(dá)的差異，確定了40種大鼠肝再生相關(guān)核蛋白，然后將這些核蛋白表達(dá)譜數(shù)據(jù)輸入信號(hào)通路分析系統(tǒng)(I

4、ngenuityPathwayAnalysis，IPA)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述肝再生相關(guān)核蛋白的作用包括以下幾方面:
　　 （一）DNA損傷修復(fù)與復(fù)制起始:聚合酶POLD表達(dá)上調(diào)，與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和復(fù)制因子C(RFC)等輔助蛋白一起起始前導(dǎo)鏈的合成，同時(shí)參與DNA聚合酶α/引物酶復(fù)合物引發(fā)的岡崎片段合成;解旋酶WRN表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)DNA復(fù)制、修復(fù)和重組;DNA引物酶PRIM1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞DNA復(fù)制;DNA損傷

5、誘導(dǎo)表達(dá)蛋白GADD45A表達(dá)上調(diào)，通過p38MAPK、mTOR/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)DNA修復(fù)和細(xì)胞分裂G2/M轉(zhuǎn)換。
　　 （二）促進(jìn)細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白啟動(dòng):剪接因子SRSF2、SRSF5、SFPQ表達(dá)上調(diào)加速相關(guān)PH誘導(dǎo)mRNA的加工，為順利啟動(dòng)肝再牛提供后勤保障:CENPW在PH后迅速積累表明肝細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)向分裂狀態(tài)轉(zhuǎn)變，增殖行為迅速活躍;核纖層蛋白LMNB1、LMNB2的積累導(dǎo)致核膜崩解，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂中期;轉(zhuǎn)

6、錄調(diào)節(jié)因子NPM1和SRSF2激活TP53，參與細(xì)胞內(nèi)核糖體合成、中心體復(fù)制、蛋白質(zhì)折疊、組蛋白裝配、細(xì)胞增殖、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié);周期蛋白CCNC調(diào)控CDK2的活性，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子BARD1，進(jìn)而激活NPM1活性，通過MMP8清除細(xì)胞外多余基質(zhì)、促進(jìn)細(xì)胞分裂;通過HOXA7、HOXA8、HOXA10抑制細(xì)胞分化，掃清細(xì)胞分裂的障礙。
　　 （三）抗炎癥抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá):硫氧還蛋白TXN表達(dá)上調(diào)，相應(yīng)細(xì)胞

7、內(nèi)各種氧化還原反應(yīng)，誘導(dǎo)FOS/JUN的AP-lDNA結(jié)合活性，促進(jìn)下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素2(IL-2)受體TAC的表達(dá)，抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng);蛋白激酶C亞基PRKCD表達(dá)上調(diào)，磷酸化激活下游底物p53/TP53，激活死亡促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子BCLAF1/Btf,觸發(fā)BCLAF1-介導(dǎo)的p53/TP53信號(hào)通路基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗凋亡作用;PRKCD誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)和RB1的過度磷酸化，并通過NF-KB，AKT1和MAPK

8、1/3(ERK1/2)等途徑促進(jìn)細(xì)胞的存活和抵抗化療藥物。
　　 （四）細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌和肝功能恢復(fù):蛋白激酶MAPK9表達(dá)上調(diào)磷酸化調(diào)節(jié)MYC的活性，促進(jìn)DNA合成和損傷修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞分裂，加速細(xì)胞合成IL-6;轉(zhuǎn)錄因子GATA4表達(dá)上調(diào)，激活BMP、經(jīng)典的wnt受體信號(hào)通路的作用，促進(jìn)肝臟功能恢復(fù):鈣結(jié)合蛋白SIOOA4表達(dá)上調(diào)，激活I(lǐng)-KB激酶/NF-KB信號(hào)級(jí)聯(lián)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)量，促進(jìn)再生;TGFβ-1誘導(dǎo)蛋白TGFβ

9、111表達(dá)下調(diào)，通過Wnt、TGFB和整合素信號(hào)通路活性，調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素、雄激素、鹽皮質(zhì)激素和孕激素受體的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、分化和衰老。
　　 綜上所述，上述肝再生相關(guān)蛋白激活基質(zhì)重塑和傷口愈合，參與再生肝中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的生產(chǎn)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞迅速進(jìn)入細(xì)胞周期而增殖。同時(shí)，加速合成去甲腎上腺素、IL-6、TNFα、TGFβ、透明質(zhì)酸等各種激素和信號(hào)分子，激活A(yù)P1、NF-kB、STAT3、Notch、F