PPAR-γ激動劑吡格列酮預處理對順鉑誘發(fā)的急性腎損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 順鉑誘導小鼠急性腎損傷模型的建立
　　目的：臨床中經(jīng)常出現(xiàn)藥物導致的急性腎損傷，原本復雜的疾病變得更加難以治療。本研究探討藥物順鉑誘導小鼠急性腎損傷模型，及其可能的發(fā)病機制。
　　方法：體重為20-25g的雄性C57/BL6小鼠分別給予生理鹽水和不同濃度（10，15，20，25，30g/kg）的順鉑腹腔注射。注射后72小時收集小鼠血清，離心收集血漿檢測血清肌酐和尿素氮以評

2、估腎功能。在確定順鉑誘導小鼠急性腎損傷最佳濃度后，給予小鼠最佳濃度的順鉑和和生理鹽水腹腔注射，分別于注射后（24，48，72，96小時）收集小鼠血清及腎臟標本，離心收集血漿送檢驗科檢測肌酐和尿素氮以評估腎功能。順鉑和生理鹽水注射后72小時腎臟標本行PAS染色以觀察腎臟形態(tài)結構的變化并評分以評估腎臟損傷程度。
　　結果：隨著順鉑注射濃度的增加（0，10，15，20，25，30）mg/kg，小鼠血肌酐和尿素氮明顯增加，其肌酐和尿素氮分

3、別為（13±2，40±5，81±7，103±6，160±12，256±21）μmol/L和（11±2，15±4，28±6，55±9，75±11，80±9)mmol/L，腎功能急劇下降，甚至發(fā)生不可逆性腎損傷，引起腎衰竭。隨著時間的推移（0，24，48，72，96小時），腎臟損傷先增加，后減輕，在順鉑注射后72小時達到最大腎臟損傷，其肌酐和尿素氮分別為（13±2，15±3，50±7，160±12，110±15）μmol/L和（11±2，1

4、2±2，45±6，75±11，50±9)mmol/L。對照組相比，順鉑可導致腎小管上皮細胞明顯腫脹壞死，蛋白管型形成和淋巴細胞浸潤，其損傷評分分別為（4±2）分和（0.5±0.5）分（*P<0.05）。
　　結論：順鉑誘導小鼠急性腎損傷呈濃度依賴性，而與注射時間呈先增加，后減輕表現(xiàn)，用藥后72小時急性腎損傷最嚴重。
　　第二部分 PPAR-γ激動劑吡格列酮預處理對順鉑誘導的急性腎損傷保護作用及機制
　　目的：探討PPA

5、R-γ激動劑吡格列酮預處理對順鉑誘導的急性腎損傷的保護作用并初步探索其可能的機制。
　　方法：體重為20-25g的雄性C57/BL6小鼠腹腔注射25mg/kg順鉑構建急性腎損傷模型。在順鉑注射前3天分別給予生理鹽水(順鉑組)，吡格列酮（吡格列酮組）或吡格列酮和PPAR-γ抑制劑GW9662（GW組）灌胃預處理，每天1次，連續(xù)3天。在順鉑注射后（0，24，48，72）小時收集小鼠血清及腎臟標本。血清檢測血肌酐與尿素氮；腎臟標本行PA

6、S染色；免疫組織化學檢測腎臟嗜中心粒細胞MPO的表達，ELISA檢測血清中促炎癥細胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6表達水平。RT-PCR檢測促炎癥細胞因子KIM-1，TNF-α，IL-6，IL-1β的mRNA水平。
　　結果：與對照組血肌酐和尿素氮（17±5)μmol/L和(9±3)mmol/L）相比，順鉑可導致血肌酐和尿素升高，在72小時達到峰值分別為（160±13)μmol/L和(70±4)mmol/L（*P<0.05）

7、。與順鉑組相比，經(jīng)過吡格列酮預處理后，肌酐和尿素氮均明顯下降，分別為（45±4)μmol/L和(17±4)mmol/L(*P<0.05)，但給予吡格列酮和GW9662聯(lián)合預處理后，肌酐和尿素氮無明顯下降，分別為（168±9)μmol/L和(76±6)mmol/L（P>0.05）。與對照組相比，其損傷評分為（0.5±0.5）分，順鉑可導致腎小管上皮細胞明顯腫脹壞死、蛋白管型形成和炎癥細胞浸潤，其損傷評分為(4±2)分（*P<0.05）。與

8、順鉑組相比，經(jīng)吡格列酮預處理可以明顯降低腎小管上皮細胞腫脹，壞死、蛋白管型形成和炎癥細胞浸潤，其損傷評分為(1±1)分（*P<0.05)，但給予吡格列酮和GW9662聯(lián)合預處理后，病理改變無明顯減輕，損傷評分為(5±1)分（P>0.05）。與對照組相比KIM-1mRNA水平(1±1)，順鉑可導致KIM-1表達升高，在48小時達到峰值，mRNA水平為（32±3)（*P<0.05）。與順鉑組相比，吡格列酮組KIM-1表達明顯下降，mRNA水

9、平為（17±4）（*P<0.05)，但GW組KIM-1表達無明顯下降，mRNA水平為（35±3）（P>0.05）。對照組腎組織幾乎無MPO（1±1）表達，順鉑組MPO表達顯著升高，達到（7±2）個（*P<0.05）。與順鉑組相比，經(jīng)過吡格列酮預處理后，MPO表達明顯下降（2±1）個(*P<0.05)，但給予吡格列酮和GW9662聯(lián)合預處理后，MPO表達無明顯下降，為（6±2）個（P>0.05）。與對照組腎臟促炎癥細胞因子(TNF-α，I

10、L-6和IL-1β) mRNA表達水平相比，順鉑可導致TNF-α，IL-6和IL-1βmRNA表達明顯升高，在72小時達到峰值（*P<0.05）。吡格列酮組與順鉑組和GW組相比，TNF-α，IL-6和IL-1βmRNA表達明顯下降(P<0.05)。與對照組TNF-α，IL-6和IL-1β分泌水平相比，順鉑可導致TNF-α，IL-6和IL-1β分泌明顯增多，在72小時達到峰值（*P<0.05）。吡格列酮組與與順鉑組和GW組相比，TNF-α

11、，IL-6和IL-1β分泌明顯減少（P<0.05）。
　　結論：PPAR-γ激動劑吡格列酮預處理可顯著減輕順鉑誘導的急性腎損傷，而阻斷PPAR-γ后，不能改善急性腎損傷，機制上研究提示PPAR-γ激動劑可通過減輕炎癥反應而減輕急性腎損傷。
　　第三部分 PPAR-γ激動劑吡格列酮抑制炎癥反應與促進AMPK激活有關
　　目的：探討PPAR-γ激動劑吡格列酮對順鉑誘導的急性腎損傷小鼠發(fā)揮抗炎作用的機制。
　　方法：在

12、體重為20-25g的雄性C57/BL6小鼠腹腔注射25g/kg順鉑構建小鼠急性腎損傷模型。在順鉑注射前3天分別給予生理鹽水(順鉑組)，吡格列酮（吡格列酮組）或吡格列酮和GW9662（GW組）灌胃預處理，每天一次，連續(xù)3天。在順鉑注射后（0，24、48，72）小時收集小鼠腎臟標本。RT-PCR檢測腎臟標本中PPAR-γ，CD36，AMPK，SIRT1和p300 mRNA水平，western blotting檢測PPAR-γ，p-PPAR-

13、γ，AMPK，p-AMPK，SIRT1，p-p300，p300，Acep65，p-IκB-α，IκB-α，p65蛋白表達水平，SIRT1活性試劑盒檢測SIRT1活性，p300活性試劑盒檢測p300活性，免疫共沉淀檢測腎臟標本中p300與p65，SIRT1與p65的結合。
　　結果：與對照組相比，順鉑對PPAR-γ，p65，p300，AMPK mRNA表達無明顯影響，（P>0.05）。吡格列酮組與吡格列酮和GW組相比，PPAR-γ，

14、p65，p300，AMPK mRNA表達無明顯差異（P>0.05）。與對照組相比，順鉑可以明顯增加CD36的mRNA表達（*P<0.05）。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組CD36mRNA的表達明顯增加（P<0.05）。與正常組相比，順鉑可以明顯減少SIRT1mRNA表達（*P<0.05）。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組SIRT1mRNA表達明顯增加（P<0.05）。與對照組相比，順鉑對腎臟PPAR-γ，p65，p300，AMPK蛋白

15、表達無明顯影響（P>0.05）。與對照組相比，順鉑可增高p-PPAR-γ，p-AMPK蛋白表達（*P<0.05）。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組p-PPAR-γ，p-AMPK表達明顯增加（P<0.05）。與對照組相比，順鉑可導致p-p300和acep65，胞漿中的p-IκB-α與胞核中的p65蛋白表達水平明顯增高（*P<0.05）。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組p-p300和acep65，胞漿中的p-IκB-α與胞核中的p65表達減

16、少（P<0.05）。與對照組相比，順鉑可導致SIRT1，IκB-α，胞漿中p65表達減少（*P<0.05）。與順鉑組和GW相比，吡格列酮組SIRT1，IκB-α，胞漿中p65表達增高（P<0.05）。與對照組相比，順鉑可減少SIRT1活性。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組SIRT1活性增加。與正常組相比，順鉑可增加p300活性，與順鉑組和GW9662組相比，吡格列酮組p300活性下降。
　　結論：吡格列酮可通過激活AMPK-SIR