YdiV負調控細胞鞭毛合成的分子機制研究.pdf

1、鞭毛是很多細菌具有的運動器官。自然界中的細菌，利用鞭毛的推動，運動到營養(yǎng)物質更豐富、更有力于其生存的環(huán)境中。有些致病菌的鞭毛還與其致病性密切相關。例如，在致病菌侵染人體初期，鞭毛功能正常的細菌能較快吸附到人體細胞上，依靠鞭毛的推動突破人體表皮粘膜的防護。而失去鞭毛的菌株將失去吸附能力，從而喪失其致病性。因此，細菌鞭毛的合成途徑是設計新型抗菌藥物的重要的靶點之一。
　　 細菌的鞭毛實際上是一個大的蛋白質復合體，鞭毛蛋白的合成和組裝

2、由一系列的蛋白共同參與來完成。鞭毛基因的轉錄和翻譯都有著嚴格的時序性。大腸桿菌基因組中有超過25個操縱子、近60個基因直接參與鞭毛的合成過程。根據(jù)基因的轉錄順序的不同，這些基因被分為三類:第一級鞭毛基因，第二級鞭毛基因和第三級鞭毛基因。處于整個流程最上游的、最先被轉錄和表達的是flhDC操縱子。此操縱子中包含flhD和flhC兩個基因。這兩個基因的表達產物組裝成異源蛋白質六聚體FlhD4C2。FlhD4C2復合物能夠結合在第二級鞭毛基因

3、上游的啟動子位置，是啟動這些基因的轉錄所必需的。第二級鞭毛基因包含編碼組成基體和鉤型鞘的蛋白質、鞭毛特異的三型分泌系統(tǒng)的組分蛋白及鞭毛特異的轉錄因子δ28的基因。第三級鞭毛基因的表達產物包括鞭毛組裝蛋白、調控鞭毛功能的蛋白以及一些未知功能的蛋白。鞭毛基因這種分層調控的特征在革蘭氏陰性細菌中是高度保守的。
　　 鞭毛蛋白的表達和鞭毛的合成過程是高度有序的過程，鞭毛的調控也會受到很多因子的在不同層次的調控。對于flhDC操縱子的調控

4、是最關鍵的調控點，多種調控因子分別在DNA，mRNA以及蛋白水平上對于此操縱子進行調控。本文的研究對象YdiV是最近被識別的、在蛋白水平上調控FlhDC功能的蛋白。
　　 YdiV屬于負責降解C-di-GMP的EAL蛋白家族中的一員。但YdiV序列中負責催化C-di-GMP降解所必需的10個保守的氨基酸中8個發(fā)生了突變。也就是說YdiV可能不具有降解C-di-GMP的功能。早期的研究發(fā)現(xiàn)這個蛋白功能與EAL的同源蛋白有很大不同:

5、正常EAL結構域的蛋白正調控細菌的移動性，而YdiV蛋白顯著抑制細菌的鞭毛合成和移動性;YdiV蛋白對細胞內C-di-GMP濃度的影響也存在著爭議。2011年，Wada等將沙門式菌中YdiV蛋白的作用對象鎖定在FlhDC復合物上，但這一過程中的具體機制仍然不明確。另外，2012年Takaya等人研究發(fā)現(xiàn)YdiV協(xié)助ClpXP蛋白酶降解FlhDC復合物，而本身不被降解。這一過程的機制也未知。本論文研究試圖通過結構生物學、生物化學、分子生物

6、學及微生物學的多種實驗方法結合來揭示YdiV抑制細菌移動性這一過程的分子機制。
　　 本論文的主要研究內容和結論如下:
　　 (1)使用蛋白質晶體X射線衍射法解析得到了1.9(A)分辨率的大腸桿菌YdiV蛋白結構。將YdiV結構與其他EAL結構進行對比發(fā)現(xiàn)兩者在折疊類型上較相似，但是結構細節(jié)有較大的差別。與其他EAL蛋白不同，YdiV在溶液中以單體形式存在。雖然YdiV不能結合C-di-GMP，但保守的C-di-GMP結

7、合凹槽仍然存在。YdiV的結構中，此凹槽中結合了一個甘油分子和一個磷酸分子。這說明YdiV雖不能結合C-di-GMP，但其可能結合某些比C-di-GMP小的、構象類似的小分子，由此來調控其下游的功能。
　　 (2)首次驗證了大腸桿菌YdiV蛋白的FlhDC的相互作用。并將YdiV相互作用的對象鎖定在FlhD上。為了找到與YdiV相互作用的最小FlhD片段，克隆了四個FlhD片段-FlhD1-71aa，F(xiàn)lhD1-82aa，F(xiàn)lh

8、D1-98aa，F(xiàn)lhD1-106aa。將于YdiV相互作用的區(qū)域確定為FlhD的N端71個氨基酸。EMSA實驗發(fā)現(xiàn)Ydiv抑制FlhDC結合DNA呈現(xiàn)濃度效應:當YdiV的濃度比較低時，YdiV與FlhDC形成的復合物還能結合DNA，但當YdiV與FlhDC的比例超過3以后，形成的復合物就不能結合DNA。
　　 (3)使用蛋白質晶體X射線衍射法解析得到了2.9(A)分辨率的YdiV-FlhD復合物的結構。結構分析結合生化實驗證

9、明，在溶液狀態(tài)下復合物以YdiV2-FlhD2四聚體的形式存在。YdiV的第6、7、8個α螺旋與FlhD的第1、4個α螺旋組成兩蛋白的相互作用面。復合物結構中YdiV、FlhD與各自的單體結構的構象變化都不大，但參與相互作用的具體氨基酸有比較大的構象變化。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，參與YdiV與FlhD相互作用的氨基酸在所有腸道細菌中都非常保守，暗示其他腸道細菌中YdiV同源蛋白通過相同的機制發(fā)揮功能。
　　 (4)通過對FlhD4C2

10、復合物的結構分析，找到了位于蛋白質表面可能與DNA結合有關的正電荷密集的區(qū)域。并通過定點突變的方法，克隆并純化得了多種FlhD4C2的突變體。EMSA實驗證明突變體蛋白都完全喪失了DNA結合的活性。這一數(shù)據(jù)有力的證明，F(xiàn)lhC上正電荷富集的區(qū)域和環(huán)狀結構都是FlhD4C2結合DNA所必須的。DNA主要結合在FlhC亞基上，而FlhD亞基對于形成和穩(wěn)定FlhD4C2環(huán)狀結構和DNA結合都是必不可少的。最后，提出了FlhD4C2復合物與DN

11、A相互作用的模型:DNA與FlhC上正電荷富集的區(qū)域互作，并被FlhC上的鋅指結構固定。整體構象上，DNA呈現(xiàn)一定的彎曲度，并且DNA是環(huán)繞FlhC亞基的。
　　 (5)通過YdiV-FlhD結構與FlhD4C2結構的疊合，模擬出了YdiV1-FlhD4C2，YdiV2-FlhD4C2.YdiV3-FlhD4C2和YdiV4-FlhD4C2四種三元復合物的結構模型。使用負染電鏡的方法觀察到了不同構象的YdiV-FlhDC三元復合

12、物，驗證了我們提出的三元復合物結構模型。
　　 (6)構建了多種YdiV突變體來進一步驗證突變體功能。發(fā)現(xiàn)不能與FlhD互作的YdiV突變體也都不能抑制FlhD4C2的DNA結合活性，并且不影響細菌的移動性。說明YdiV蛋白影響細菌移動性的原因確實是由其與FlhD相互作用而引發(fā)的。另外，我們分析YdiV-FihD結構，設計了沙門式菌同源蛋白CdgR的一些突變體。使用Pulldown方法檢測了這些突變體與stFlhD和stFlhD

13、C的相互作用。實驗數(shù)據(jù)暗示沙門氏菌CdgR蛋白與YdiV蛋白的作用機制是類似的。
　　 (7)對YdiV蛋白與ClpX蛋白相互作用情況進行了初步的研究。YdiV與ClpX的ZBD結構域在體內共轉共純化時存在相互作用，而當分別提純得到兩種蛋白在體外卻檢測不到蛋白間的相互作用。提出細胞內某小分子（與C-di-GMP有類似的結構）可能結合到YdiV的疏水口袋調控YdiV與CipX的相互作用的假說。
　　 根據(jù)以上實驗結果，提出

14、了YdiV負調控細菌鞭毛合成和移動性的分子機制模型:溶液中的YdiV蛋白以單體形式存在。YdiV蛋白主要通過第8個α螺旋與FlhD分子上第1和第4個α螺旋相互作用。在FlhD4C2復合物中，四個FlhD分子(D1，D2，D3，D4)所處的狀態(tài)不同。D1-D2和D3-D4各自組成二聚體。而D2和D3分子的相互作用面也是由其第1和第4個α螺旋介導的。由于D1和D4分子的第1和第4個α螺旋是暴露的，所以當YdiV分子處于較低的濃度時，YdiV

15、分子優(yōu)先結合在這兩個FlhD分子上。DNA結合在FlhD4C2復合物的FlhC亞基外側上，幾乎不與FlhD接觸。所以YdiV結合在D1和D4上時候，形成的YdiV1FlhD4C2和YdiV2FlhD4C2三元復合物還能和DNA結合，這時FlhDC的轉錄因子活性并沒有受到抑制。當YdiV濃度升高到一定程度，當所有的D1和D4亞基都被飽和的時候，YdiV就開始吸附D2或D3分子。這時由于YdiV的侵入，F(xiàn)lhD4C2六元環(huán)狀結構被迫打開。目

16、的DNA與FlhD4C2結合是一個精確的定位過程，DNA結合到FlhD4C2分子上時呈現(xiàn)一定的弧度，F(xiàn)lhD4C2的圓環(huán)狀構象對于其結合DNA的能力也是必不可少的。多個YdiV結合導致FlhD4C2六元環(huán)狀結構被破壞，DNA將不能結合到此復合物上。這時FlhD4C2轉錄輔助因子的功能喪失，第二級及之后的鞭毛蛋白停止表達。最終導致鞭毛合成受阻，細菌的移動性減弱甚至消失。FlhD4C2復合物結合過量YdiV后環(huán)狀結構打開，結構變的疏松。Yd

17、iV蛋白通過與細胞內ClpXP蛋白酶的ClpX亞基的ZBD結構域互作，促進其結合的FlhD4C2復合物被ClpXP蛋白酶降解掉。YdiV調控鞭毛表達和細菌移動性的過程是濃度依賴的并且是不可逆的。
　　 細胞內YdiV的濃度受到很多因素的影響。已有文獻報道，外界葡萄糖的濃度顯著影響細胞內YdiV蛋白的濃度。另外，ydiV基因轉錄活性受轉錄調控因子SdiA蛋白的調節(jié)，而SdiA蛋白與DNA的結合活力又受細菌產生的自誘導物的直接影響。

18、即細菌所處環(huán)境的菌濃的不同，細胞內的YdiV的濃度也會不同。我們的研究發(fā)現(xiàn)只有在YdiV濃度足夠高時，細菌的鞭毛合成才會完全停止。細菌的鞭毛表達是個十分耗時和耗能的過程，細菌鞭毛合成與否是細菌生命狀態(tài)的一個重大決定。只有當外界信號分子的濃度足夠大并且持續(xù)時間足夠長時，細胞內的YdiV的表達量才會積累到足夠的濃度，這時細菌的鞭毛合成才被迫從源頭終止。YdiV蛋白作為EAL蛋白家族的一員，其發(fā)揮的功能與正常EAL蛋白南轅北轍。這一現(xiàn)象給我們